王小芳，賈培增

1 商丘工學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床系，河南商丘476000；2 北京大學(xué)口腔醫(yī)院

口腔鱗癌(OSCC)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤總數(shù)的90%以上。在我國(guó)OSCC的發(fā)病率為3.6/10萬(wàn)～8.0/10萬(wàn)，近年來(lái)其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1～3]。OSCC早期即可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，屬于隱匿性微轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，約40%的早期OSCC患者存在隱匿性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這可能是患者病死率較高的重要原因之一[4]。OSCC傳統(tǒng)治療方法為手術(shù)切除、局部放療、全身化療等，雖然這些治療手段在不斷改進(jìn)，但患者5年生存率依然無(wú)明顯提高[5，6]。目前，OSCC發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索與OSCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子，對(duì)其早期診斷、靶向治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要意義。轉(zhuǎn)導(dǎo)素β1X連鎖受體蛋白1(TBL1XR1)是大多數(shù)組織中普遍存在的核蛋白，含F(xiàn)-box/WD40重復(fù)序列，在信號(hào)通路的調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用[7，8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中TBL1XR1表達(dá)失調(diào)，其異常表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[9～11]。但干擾TBL1XR1表達(dá)能否抑制OSCC細(xì)胞增殖和遷移尚不清楚。為此，2017年1月～2018年12月，本研究觀察了干擾TBL1XR1表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和遷移的影響，并初步探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人OSCC細(xì)胞系Cal-27(以下稱Cal-27細(xì)胞)，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。TBL1XR1 shRNA、scramble shRNA，上海漢恒生物科技有限公司。所有引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。7500型熒光定量RCR儀，美國(guó)ABI公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；Transwell小室，美國(guó)Coring公司；電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix EX TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司。RIPA裂解液，上海貝博生物科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Thermo公司；JAK2與磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3與磷酸化STAT3(p-STAT3)、GAPDH單克隆抗體及HRP標(biāo)記的IgG二抗，英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將Cal-27細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合95%左右時(shí)，按1∶3傳代。取傳2代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Cal-27細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔鋪于6孔板，隨機(jī)分為無(wú)關(guān)序列組、TBL1XR1干擾組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入TBL1XR1 shRNA、scramble shRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)轉(zhuǎn)染。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：TBL1XR1上游引物5′-CACCCGCTGCATTGATTTCTA-3′，下游引物5′-TACGGCATCTATCAGGGACAG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用MTS法。收集兩組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。然后將96孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入MTS 30 μL，37 ℃孵育2 h，采用MK3型酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。以O(shè)D490值代表細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。收集兩組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，以300個(gè)/孔接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。然后將96孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)基。直至肉眼可見(jiàn)克隆團(tuán)形成時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，拍照觀察，肉眼計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。收集兩組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。將Transwell小室的上室加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入含500 μL完全培養(yǎng)基的24孔板，然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去Transwell小室上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)100倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集兩組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒鑒定，提取的細(xì)胞總蛋白濃度合格。然后加入5×上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE分離蛋白并將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。取出PVDF膜，用5% BSA室溫封閉1 h，分別加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH單克隆抗體(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光、曝光、顯影，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組TBL1XR1 mRNA表達(dá)比較 TBL1XR1干擾組與無(wú)關(guān)序列組TBL1XR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.06、1.00±0.05。TBL1XR1干擾組TBL1XR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)關(guān)序列組(t=30.53，P<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞增殖活性比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較

注：與無(wú)關(guān)序列組比較，*P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞增殖能力比較 TBL1XR1干擾組與無(wú)關(guān)序列組克隆形成數(shù)目分別為(41.25±10.36)、(89.33±15.06)個(gè)。TBL1XR1干擾組克隆形成數(shù)目低于無(wú)關(guān)序列組(t=18.74，P<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞遷移能力比較 TBL1XR1干擾組與無(wú)關(guān)序列組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(63.29±14.03)、(104.58±17.52)個(gè)。TBL1XR1干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)低于無(wú)關(guān)序列組(t=20.57，P<0.05)。

2.5 兩組JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

3 討論

據(jù)WHO預(yù)計(jì)，在未來(lái)十幾年中OSCC的發(fā)病率將持續(xù)上升，已然成為一種威脅人類健康和嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。OSCC傳統(tǒng)治療方法為手術(shù)切除、局部放療、全身化療等，但由于OSCC早期即可發(fā)生隱匿性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致傳統(tǒng)治療方法療效較差，患者5年生存率低于50%[5，6]。因此，尋找新的治療方法對(duì)改善OSCC患者預(yù)后具有重要意義。分子靶向治療是近年來(lái)發(fā)展非常迅速的新型治療方式，已用于EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌和ErbB2陽(yáng)性的乳腺癌，并呈現(xiàn)出良好的治療效果。但目前臨床缺乏OSCC治療有效的藥物靶點(diǎn)，而這些有效的藥物靶點(diǎn)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子。因此，從分子水平上探索OSCC的發(fā)病機(jī)制，是尋找OSCC藥物靶點(diǎn)的關(guān)鍵。

表2 兩組JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與無(wú)關(guān)序列組比較，*P<0.05。

TBL1XR1基因定位于人染色體3q26.32，由18個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度為178 119 bp。TBL1XR1是維甲酸和甲狀腺激素受體復(fù)合物的沉默介質(zhì)，也是核受體輔阻遏物的核心成分，可調(diào)控各種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性[7，8]。有研究報(bào)道，TBL1XR1在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤和漿液性上皮性卵巢癌等組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)與腫瘤惡性進(jìn)展和患者預(yù)后不良密切相關(guān)[9～12]。Liu等[13]研究認(rèn)為，TBL1XR1是腫瘤分子靶向治療潛在的靶標(biāo)。但目前TBL1XR1在OSCC發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。在人類癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA中，頭頸部鱗癌(HNSCC)組織TBL1XR1表達(dá)明顯高于正常組織，這些HNSCC組織起源于口腔、喉、咽等鱗狀上皮，占全身惡性腫瘤的4.7%～20.3%[3]。而OSCC的發(fā)病率在HNSCC中居第二位[14]。由此推測(cè)，TBL1XR1在OSCC組織中表達(dá)升高。有研究發(fā)現(xiàn)，TBL1XR1在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤惡性進(jìn)展和患者預(yù)后不良有關(guān)。Zhang等[9]采用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中TBL1XR1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞存活、增殖和遷移能力均明顯降低；干擾TBL1XR1表達(dá)，無(wú)論是在體外還是在體內(nèi)均能降低骨肉瘤干細(xì)胞樣表型和腫瘤細(xì)胞的致瘤性[12]；沉默TBL1XR1表達(dá)能夠抑制漿液性上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[15]。結(jié)果提示，TBL1XR1與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾Cal-27細(xì)胞TBL1XR1表達(dá)，經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證，TBL1XR1干擾組TBL1XR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)關(guān)序列組，表明該技術(shù)能夠下調(diào)Cal-27細(xì)胞中TBL1XR1表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TBL1XR1干擾組細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞增殖和遷移能力均低于無(wú)關(guān)序列組。提示TBL1XR1能夠參與OSCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但其具體的分子機(jī)制仍不清楚。

在非小細(xì)胞肺癌中，TBL1XR1能夠通過(guò)主調(diào)節(jié)因子c-Met調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶和蛋白激酶B信號(hào)途徑，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷轉(zhuǎn)以及化療耐藥[9]。在漿液性上皮性卵巢癌中，沉默TBL1XR1表達(dá)能夠通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力[15]。而Zhou等[16]研究報(bào)道，TBL1XR1可能通過(guò)激活β-catenin/MMP-7/EGFR/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。由此可見(jiàn)，TBL1XR1在不同惡性腫瘤中的作用途徑并不一致，可能存在多種調(diào)控信號(hào)通路。JAK2/STAT3信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性增殖、侵襲和遷移的重要信號(hào)通路之一[17]。在正常條件下，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活受到嚴(yán)格調(diào)控，JAK2和STAT3激活的時(shí)間較短，但能促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。在病理?xiàng)l件下，JAK2/STAT3信號(hào)通路受到持續(xù)性刺激，JAK2和STAT3激活的時(shí)間延長(zhǎng)，JAK2和STAT3發(fā)生磷酸化，磷酸化的JAK2和STAT3能夠進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路在OSCC細(xì)胞中處于異常活化狀態(tài)[19，20]。但干擾TBL1XR1表達(dá)抑制OSCC細(xì)胞增殖和遷移是否與JAK2/STAT3信號(hào)通路異?；罨嘘P(guān)尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBL1XR1干擾組JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-JAK2、p-STAT3相對(duì)表達(dá)量均低于無(wú)關(guān)序列組，而兩組JAK2、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Xi等[12]報(bào)道基本一致。提示JAK2/STAT3信號(hào)通路異常激活可能是TBL1XR1促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖和遷移能力的重要途徑之一。

綜上所述，干擾TBL1XR1表達(dá)能夠抑制OSCC細(xì)胞增殖和遷移能力，其作用可能是通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白實(shí)現(xiàn)的。TBL1XR1有可能成為治療OSCC的分子靶標(biāo)。