祁美霞，李曉娟，盧慧，李宏

1 天津市第五中心醫(yī)院，天津300450；2 中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位，在全球范圍內每年約有新發(fā)病例50萬例，死亡約26萬例。近年來，宮頸癌的發(fā)病率明顯上升并呈年輕化趨勢，已成為威脅女性生殖健康的惡性疾病之一[1]。目前，宮頸癌的治療方式主要有手術、放化療、分子靶向治療等，特別是新的靶向藥物出現(xiàn)和新的輔助治療模式應用，明顯提高了臨床療效，延長了患者總體生存時間[2]。但中晚期宮頸癌局部病灶難以控制，易發(fā)生淋巴結轉移或遠處轉移，這些治療方式效果有限，患者預后較差，5年總體生存率僅40%[3]。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因信使RNA的3′非翻譯區(qū)結合，降低靶基因信使RNA的穩(wěn)定性，促進RNA降解，從而調控靶基因表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅能夠參與細胞增殖、分化、代謝等生理過程，還能在炎癥反應、免疫反應及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。miR-362屬于miRNA家族成員之一，其基因定位于人染色體Xp11.23。研究表明，腫瘤組織miR-362低表達，其低表達能夠促進腫瘤生長、侵襲和轉移，并與患者預后不良密切相關[5]。六同源框1(SIX1)基因定位于人染色體14q23.1，其編碼蛋白是同源盒蛋白，能夠參與個體的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，SIX1蛋白在結直腸癌[6]、前列腺癌[7]等人類惡性腫瘤組織中過表達，其過表達能夠通過上調血管內皮生長因子表達刺激腫瘤血管生成，并可通過增加巨噬細胞特異性集落刺激因子、趨化因子配體2/5表達，募集腫瘤相關巨噬細胞，從而促進腫瘤生長和轉移。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中SIX1基因表達受miR-362轉錄后調控的影響，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。但目前miR-362、SIX1在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究觀察了宮頸癌組織miR-362、SIX1 mRNA表達變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年4月～2016年4月天津市第五中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者81例。所有患者經(jīng)組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合宮頸癌診斷；②初診；③既往未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他組織或器官惡性腫瘤者；②有宮頸炎、宮頸上皮內瘤變等宮頸疾病史或宮頸手術史者；③合并嚴重肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者；④合并精神障礙性疾病者?；颊吣挲g30～74(47.2±7.1)歲；病理類型：鱗癌65例，腺癌16例；組織分化程度：高中分化53例，低未分化28例；FIGO分期[9]：Ⅰ期24例，Ⅱ、Ⅲ期57例；肌層浸潤深度：淺肌層39例，深肌層42例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移37例。本研究經(jīng)天津市第五中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-362、SIX1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。收集手術切除的宮頸癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>3 cm，并經(jīng)組織病理檢查證實為正常宮頸組織)，置于凍存管中，液氮轉運至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。實驗前，取宮頸癌組織與癌旁正常組織各約50 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：miR-362上游引物5′-ATCCTTGGAACCTAGGTGTGAGT-3′、下游引物5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′，內參U6上游引物5′-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3′、下游引物3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′；SIX1上游引物5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′、下游引物5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′，內參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，去離子水4 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、58 ℃退火40 s、72 ℃延伸15 s共40個循環(huán)。以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后以門診或電話等形式定期隨訪，隨訪截至2019年4月，終點事件為患者死亡，統(tǒng)計患者生存情況，計算3年總體生存率。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織miR-362、SIX1 mRNA表達比較 宮頸癌組織與癌旁正常組織miR-362相對表達量分別為0.671±0.215、4.612±0.891，SIX1 mRNA相對表達量分別為4.793±0.740、1.147±0.331。宮頸癌組織miR-362相對表達量低于癌旁正常組織，SIX1 mRNA相對表達量高于癌旁正常組織(t分別為38.707、40.478，P均<0.05)。

2.2 宮頸癌組織miR-362表達與SIX1 mRNA表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，宮頸癌組織miR-362相對表達量與SIX1 mRNA相對表達量呈負相關關系(r=-0.620，P均<0.05)。

2.3 宮頸癌組織miR-362、SIX1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 宮頸癌組織miR-362、SIX1 mRNA表達均與FIGO分期、組織分化程度有關(P均<0.05)，而與年齡、病理類型、肌層浸潤深度和淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

2.4 宮頸癌組織不同miR-362、SIX1 mRNA表達與患者預后的關系 至隨訪截至日期，所有患者隨訪2～36個月，中位隨訪時間27.5個月，隨訪期間死亡15例，無失訪病例。

以宮頸癌組織miR-362相對表達量的均數(shù)0.671為臨界值，將患者分為miR-362高表達者41例、miR-362低表達者40例。miR-362高表達者與低表達者3年總體生存率分別為90.2%(37/41)、72.5%(29/40)。miR-362高表達者3年總體生存率高于miR-362低表達者(χ2=4.083，P<0.05)。見圖1a。

以宮頸癌組織SIX1 mRNA相對表達量的均數(shù)4.793為臨界值，將患者分為SIX1 mRNA高表達者42例、SIX1 mRNA低表達者39例。SIX1 mRNA高表達者與低表達者3年總體生存率分別為69.0%(29/42)、94.8%(37/39)。SIX1 mRNA高表達者3年總體生存率低于SIX1 mRNA低表達者(χ2=5.502，P<0.05)。見圖1b。

3 討論

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來，我國宮頸癌的發(fā)病率和病死率逐漸上升，并呈年輕化趨勢[10]。有研究表明，宮頸癌是唯一病因明確、可防可治的惡性腫瘤。宮頸涂片、液基細胞學技術、人乳頭瘤病毒檢測等是宮頸癌篩查和早期診斷的重要手段。但在許多經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，宮頸癌篩查覆蓋率較低，許多宮頸癌患者就診時已發(fā)展至中晚期，即使經(jīng)手術、放化療等綜合治療，預后仍然較差[11]。因此，探索宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找可靠的生物標志物，對疾病診斷、治療和預后判斷具有重要意義。

表1 宮頸癌組織miR-362、SIX1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

圖1 宮頸癌組織不同miR-362、SIX1 mRNA表達者預后的生存曲線

miR-362基因定位于人染色體Xp11.23。成熟的miR-362可通過調控細胞內多種轉錄因子表達，如核因子κB，從而影響細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-362在胃癌[12]、肺癌[13]等惡性腫瘤細胞中異常低表達，其低表達導致下游癌基因(如Sema3A)表達增加，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖、遷移等生物學行為。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-362相對表達量明顯低于癌旁正常組織，表明miR-362在宮頸癌組織中低表達，其機制可能與長鏈非編碼RNA(LncRNA)CASC2對miR-362的表達調控有關。有研究表明，LncRNA CASC2能夠作為分子海綿抑制miR-362表達和功能，導致miR-362的下游癌基因核因子κB表達增加，從而促進腫瘤惡性進展[14]。此外，在腫瘤發(fā)生時miR-362基因啟動子區(qū)發(fā)生表觀遺傳學修飾，如甲基化，導致miR-362基因表達沉默，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-362表達與FIGO分期、組織分化程度有關，而與年齡、病理類型、肌層浸潤深度和淋巴結轉移無關。提示miR-362低表達與宮頸癌惡性進展有關，其原因與miR-362能夠抑制磷脂酰肌醇3-激酶-C2β表達有關。有研究證實，在神經(jīng)母細胞瘤中miR-362-5p表達下降可導致磷脂酰肌醇3-激酶-C2β表達升高，從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，導致腫瘤惡性進展[16]。本研究以宮頸癌組織miR-362相對表達量的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-362高表達者與低表達者，結果發(fā)現(xiàn)miR-362高表達者3年總體生存率高于miR-362低表達者，提示miR-362低表達與宮頸癌患者預后不良有關。因此，miR-362有可能成為宮頸癌患者預后評估的分子生物標志物。

SIX1屬于同源域蛋白亞家族成員，其結構特點是含有60個氨基酸的DNA結合結構域和110～115個氨基酸的SIX結構域。SIX1基因定位于人染色體14q23.1，其編碼蛋白是一種同源盒蛋白，能夠參與個體的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，SIX1基因缺陷可導致常染色體顯性遺傳性耳聾23型和3型分支病綜合癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，SIX1在乳腺癌、肝癌和結直腸癌等腫瘤組織中異常高表達，其高表達能夠促進腫瘤惡性進展[17]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織SIX1 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，表明SIX1 mRNA在宮頸癌組織中高表達，其機制可能是腫瘤發(fā)生時負性調控SIX1基因表達的miRNA表達降低，如miR-150-5p等，導致SIX1 mRNA表達升高，引起糖酵解增加、乳酸堆積等細胞代謝性改變，從而促進腫瘤細胞增殖、浸潤和遷移[18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織SIX1 mRNA表達與FIGO分期、組織分化程度有關，而與年齡、病理類型、肌層浸潤深度和淋巴結轉移無關。提示SIX1能夠參與宮頸癌惡性進展，其機制可能是腫瘤發(fā)生時SIX1通過激活AKT/Mtor信號通路，促進腫瘤細胞上皮間質轉化，從而導致腫瘤惡性進展[19]。本研究以宮頸癌組織SIX1 mRNA相對表達量的均數(shù)為臨界值，將患者分為SIX1 mRNA高表達者與低表達者，結果發(fā)現(xiàn)SIX1 mRNA高表達者3年總體生存率低于SIX1 mRNA低表達者。表明SIX1 mRNA高表達與宮頸癌患者預后不良有關。因此，SIX1有可能成為宮頸癌患者預后評估的分子生物標志物。

在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細胞中miR-362能夠直接結合并降低SIX1基因信使RNA的穩(wěn)定性，從而抑制SIX1基因表達[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-362表達與SIX1 mRNA表達呈負相關關系，進一步證實SIX1可能受miR-362的轉錄后調控。

綜上所述，宮頸癌組織miR-362低表達、SIX1 mRNA高表達，二者表達變化與腫瘤進展和患者預后有關。miR-362、SIX1有可能成為宮頸癌診斷和預后評估的分子生物標志物。