馮海利，侯亮，姜琳娜

1 武安市第一人民醫(yī)院，河北武安056300；2 邯鄲市第一人民醫(yī)院

子宮內(nèi)膜癌是起源于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別居女性惡性腫瘤的第8、9位[1，2]。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升并呈年輕化趨勢(shì)，已成為威脅我國(guó)女性健康的主要生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[3]。手術(shù)治療是子宮內(nèi)膜癌最主要的治療方式，但部分患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，即使經(jīng)正規(guī)放化療，預(yù)后仍然較差。目前，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子對(duì)其早期診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因定位于人染色體Xq25，其編碼蛋白屬于凋亡抑制蛋白家族，能夠通過抑制半胱天冬酶(Caspase)蛋白活性，產(chǎn)生凋亡抑制作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤均存在XIAP異常表達(dá)現(xiàn)象，且其異常表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，有可能成為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[5]。線粒體促凋亡蛋白(Smac)基因定位于人染色體12q24.31，其編碼蛋白主要分布在線粒體中，在凋亡相關(guān)信號(hào)刺激下，逐漸從線粒體中釋放并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，通過氨基末端與XIAP相互結(jié)合激活半胱氨酸蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Smac低表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞無限增殖和抗藥性產(chǎn)生[7]。X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(XAF-1)基因定位于人染色體17p13.1，其編碼蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，可與XIAP結(jié)合，從而拮抗XIAP的抗凋亡作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，XAF-1低表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[8]。由此推測(cè)，XIAP、Smac、XAF-1可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，但目前相關(guān)報(bào)道較少。為此，本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月～2018年12月武安市第一人民醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌患者90例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合子宮內(nèi)膜癌診斷；②初診；③接受子宮切除手術(shù)；④入院前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②心、肝、肺等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；③妊娠期或哺乳期婦女。患者年齡33～72(49.1±10.1)歲，其中<60歲68例、≥60歲22例；腫瘤直徑2～11(5.1±1.3)cm，其中≤5 cm 59例、>5 cm 31例；子宮肌層浸潤(rùn)58例，未侵及子宮肌層32例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期67例，Ⅲ、Ⅳ期23例；病理類型：腺癌54例，腺鱗癌14例，乳頭狀腺癌12例，透明細(xì)胞癌10例；組織分化程度：高中分化52例，低未分化38例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例。本研究經(jīng)武安市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm且經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：XIAP上游引物5′-TGGTTCAGGATGCGCTGCTC-3′，下游引物5′-CCAAACATGATGACGGCACA-3′；Smac上游引物5′-GCTGCGCAGCTCAAGGGTCT-3′，下游引物5′-GCATCGTGACTGTGGGGAGC-3′；XAF-1上游引物5′-CCTTGGTTTGGGGTGAGAAGC-3′，下游引物5′-AGCCTCCCTGCCTGTCCATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，下游引物5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，20×SYBR Green 1 μL，dNTPs 1 μL，DEPC水14.8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁正常組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)比較 子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁正常組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為25.84±2.73、5.16±1.04，Smac mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.17±1.26、16.83±4.28，XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.29±0.87、22.68±5.37。子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，而Smac、XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(t分別為67.156、22.667、33.814，P均<0.01)。

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均與子宮肌層浸潤(rùn)、臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與年齡、腫瘤直徑、病理類型無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量與Smac、XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.615、-0.667，P均<0.01),Smac mRNA相對(duì)表達(dá)量與XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.697，P<0.01)。見圖1。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率已達(dá)到28.7/10萬。我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率處于較低水平，但近年有逐漸升高趨勢(shì)[9]。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其發(fā)病機(jī)制主要有腫瘤干細(xì)胞假說、腫瘤免疫逃逸假說、腫瘤抗凋亡假說等。因此，探索與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子對(duì)其早期診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。

XIAP是由Peter等學(xué)者于1996年通過PCR技術(shù)和Southern雜交克隆出來的一種凋亡抑制蛋白。在正常細(xì)胞中，XIAP通過與凋亡啟動(dòng)因子和凋亡效應(yīng)因子結(jié)合，從而發(fā)揮抗凋亡作用。近年研究表明，在乳腺癌、胃癌等腫瘤中均存在XIAP異常高表達(dá)現(xiàn)象，其高表達(dá)通過激活磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[10]。由此推測(cè)，XIAP在子宮內(nèi)膜癌中可能同樣發(fā)揮凋亡調(diào)控作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織，提示XIAP高表達(dá)可能參與子宮內(nèi)膜癌形成，其機(jī)制可能與在腫瘤組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIAP-AS1能夠促進(jìn)XIAP表達(dá)有關(guān)。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIAP-AS1能夠與轉(zhuǎn)錄因子Sp1相互作用并結(jié)合于XIAP基因啟動(dòng)子區(qū)，從而促進(jìn)XIAP表達(dá)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量與子宮肌層浸潤(rùn)、臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、腫瘤直徑、病理類型無關(guān)，提示XIAP異常表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展有關(guān)。其機(jī)制一方面可能是XIAP高表達(dá)能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性。XIAP主要通過其桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)結(jié)構(gòu)域與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9相互結(jié)合，抑制其促凋亡活性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖[12]。另一方面，XIAP表達(dá)受微小RNA(miRNA)調(diào)控，如miR-181a等，miRNA在調(diào)控XIAP表達(dá)的同時(shí)，能夠調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達(dá)，使E-鈣黏素等上皮表型蛋白表達(dá)減少，而波形蛋白等間質(zhì)表型蛋白表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[13,14]。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表達(dá)的關(guān)系

Smac基因定位于人染色體12q24.31，其編碼蛋白是一種由線粒體釋放的促凋亡因子。生理?xiàng)l件下，Smac通過激活Caspase信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。XAF-1基因定位于人染色體17p13.1，其編碼蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。生理?xiàng)l件下，XAF-1能夠與細(xì)胞質(zhì)中的XIAP結(jié)合，抑制XIAP的抗凋亡作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。同時(shí)，XAF-1還能調(diào)控TNFR信號(hào)通路、線粒體內(nèi)源性信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞程序性死亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞程序性死亡的敏感性。有研究報(bào)道，肺癌、肝癌等惡性腫瘤組織均存在Smac、XAF-1低表達(dá)現(xiàn)象[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織Smac、XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，提示二者異常表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生有關(guān)，其機(jī)制可能與Smac、XAF-1基因啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)升高，可促進(jìn)Smac、XAF-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常高甲基化，從而抑制Smac、XAF-1基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致Smac、XAF-1基因表達(dá)沉默[17]。有研究還發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶能夠使Smac啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低，從而恢復(fù)Smac的促細(xì)胞凋亡作用[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織Smac、XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均與子宮肌層浸潤(rùn)、臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、腫瘤直徑、病理類型無關(guān)。提示Smac、XAF-1異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制尚不清楚，有可能是XAF-1、Smac表達(dá)降低能夠引起NF-κB信號(hào)通路活化，導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)升高，促進(jìn)下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá)增加，最終導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量與Smac mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其原因是XIAP與Smac在功能上存在拮抗作用，XIAP的BIR-3結(jié)構(gòu)域能與Smac、Caspase中的AVP1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而Smac能夠抑制XIAP與Caspase結(jié)合。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)量與XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與以往報(bào)道[6]一致，其原因是XAF-1與XIAP結(jié)合能夠使細(xì)胞核中XIAP表達(dá)降低，從而發(fā)揮抑制IAPs家族蛋白功能的作用[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織Smac mRNA相對(duì)表達(dá)量與XAF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者可能協(xié)同促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。有研究報(bào)道，XAF-1、Smac均能通過激活TNF-α信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。但三者在子宮內(nèi)膜癌中的相互作用機(jī)制尚不完全清楚，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織XIAP表達(dá)上調(diào)，Smac、XAF-1表達(dá)下調(diào)，三者表達(dá)變化可能共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。