周劍，張麗媛，王敏，楊夢瑞，王彤彤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081)

恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、沙拉沙星(SAR)、達氟沙星(DAN)、氧氟沙星(OFL)、培氟沙星(PFL)、諾氟沙星(NFX)、洛美沙星(LFL)屬于氟喹諾酮類藥物(FQs)，是喹諾酮藥物發(fā)展到第三代的產(chǎn)物，具有殺菌效果好、抗菌譜廣、機體吸收快等優(yōu)點［1］，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動物疾?。?–3］。但使用過量或者使用不當(dāng)會導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留［4］，如進入人體易造成人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的損傷［5–6］，并產(chǎn)生細菌耐藥性［7–9］。因此歐盟、北美等國均規(guī)定FQs 在動物源食品中的最高殘留限量不得超過10～400 μg／kg［10］。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也發(fā)布了《獸藥停藥期規(guī)定》和《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》，以規(guī)范FQs 的使用［11］。

目前喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、理化檢測法和免疫檢測法等［11–12］。其中理化檢測法主要有電化學(xué)法［13］、高效液相色譜法［14–15］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［16–17］等。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也公布了基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法標準用于例行監(jiān)測工作，但檢測結(jié)果的準確性、可比性、可溯源性需要配套相應(yīng)的標準物質(zhì)才能得以保證［18］。

目前由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心研制的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星溶液標準物質(zhì)均為單一成分標準溶液；而達氟沙星只有純度標準物質(zhì)暫無溶液標準物質(zhì)；培氟沙星還沒有相關(guān)標準物質(zhì)。這些單一成分標準物質(zhì)純品或溶液，在日常使用時，需要進一步稀釋為標準儲備溶液，再根據(jù)實驗需要稀釋成工作溶液。對于多種藥物同時檢測，還要配制成混合標準工作溶液。純品標準物質(zhì)價格昂貴，每次實驗實際用量很小，造成極大浪費；同時，實驗室自行配制儲備液，不僅延長實驗準備時間，還會引入不確定的誤差，影響實驗結(jié)果。因此研制均勻、穩(wěn)定性良好、可溯源的氟喹諾酮類混合溶液標準物質(zhì)，對于保證檢測結(jié)果準確可靠、節(jié)省實驗時間和經(jīng)濟成本，以及對國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測溯源體系的建立具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AD 型，日本島津公司；

質(zhì)譜儀：Triple QuadTM3500 型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

核磁共振儀：Avance III 型，德國布魯克公司；

卡爾費休水分滴定儀：TOLEDO DL32 型，瑞士梅特勒–托利多公司；

分析天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

電子天平：UMX2 型，感量為0.001 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：X series 2 型，美國賽默飛世爾科技公司；

7 種氟喹諾酮藥物純度標準物質(zhì)：基本信息見表1。

表1 7 種氟喹諾酮類藥物純度標準物質(zhì)

培氟沙星：純度為92.19%，不確定度為1.00%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

氘代甲醇：純度為99.6%，美國西格瑪奧德里奇公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜儀

（1）測定培氟沙星原料的主成分純度。色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技公司)；流動相：流動相A 為20 mmol／L 醋酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，(流動相A 與流動相B 的體積比為45∶55)；洗脫方式：等度洗脫；流量：1 mL／min；進樣體積：10 μL；紫外檢測器波長：279 nm。

（2）測定8 種氟喹諾酮藥物混合溶液。色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技公司)；流動相：流動相A 為20 mmol／L 醋酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，流動相C 為甲醇；流量：1 mL／min；進樣體積：10 μL；紫外檢測器波長：290 nm；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源電壓：4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：55 kPa；霧化氣壓力：310 kPa；輔助氣壓力：310 kPa；掃描范圍：50～340 Da。

1.2.3 核磁氫譜儀

探頭溫度：20.25℃；掃描寬度：8 223.43 Hz；激發(fā)脈沖角度：30 度；脈沖序列：zg30；弛豫延遲時間：60 s；采樣時間：3.98 s；累計采樣次數(shù)：128 次；偏置頻率：2 464.51 Hz；接收增益：64.00；譜寬：20.00×10–6；縱向弛豫時間：8.5 s。

1.2.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀

射頻功率：1 450 W；霧化室溫度：2℃；等離子體氣：氬氣，流量為16 L／min；載氣：氬氣，流量為1.23 L／min；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.4 r／s；采樣深度：7.8 mm；同位素駐留時間：0.1 s。

1.3 原材料純度核驗

對于恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星7 種國家有證純度標準物質(zhì)，直接采用其標示量值和不確定度，對于非有證標準物質(zhì)培氟沙星，需要對其進行定性和純度核驗。

1.3.1 定性分析

采用高效液相色譜–質(zhì)譜法和核磁氫譜法對培氟沙星純品進行定性分析。

（1）高效液相色譜–質(zhì)譜法。將培氟沙星純品溶于甲醇中，配制成培氟沙星的質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的甲醇溶液，采用高效液相色譜–質(zhì)譜進行全掃描分析。

（2）核磁氫譜法。將培氟沙星純品溶于氘代甲醇中，采用1H NMR 進行氫譜分析。采樣前，調(diào)諧和勻場均先采用自動方式，取得初步信號，然后根據(jù)化合物信息，再手動調(diào)諧、勻場和調(diào)節(jié)增益。

1.3.2 定量分析

采用高效液相色譜–面積歸一化法測定培氟沙星原料的主成分純度。

1.3.3 雜質(zhì)定量方法

雜質(zhì)主要包括水分和無機離子。

水分定量采用卡爾費休水分儀進行測定。準確稱量5～10 mg 樣品，迅速加入至卡爾費休滴定池內(nèi)進行滴定，輸入稱量質(zhì)量數(shù)，讀取水分值。為了消除空氣和操作過程中水分進入滴定池對測定結(jié)果的影響，模擬加樣過程，測定實驗環(huán)境中水分值進行空白扣除。每個樣品重復(fù)測定5 次，取平均值作為測量結(jié)果。

無機離子雜質(zhì)采用微波消解–電感耦合等離子體質(zhì)譜法進行測定。稱取5 份樣品，取樣量均為1 g(精確至0.000 1 g)，置于微波消解管內(nèi)，在優(yōu)化的微波消解條件下進行消解，待消解完全后，取出內(nèi)罐，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用水定容至標線，混勻備用。同時做試劑空白。

1.3.4 8 種氟喹諾酮類藥物互為雜質(zhì)分析

8 種氟喹諾酮類藥物理化性質(zhì)十分接近，在藥物合成或提取過程中，單一組分可能會殘留微量同類物質(zhì)中的其它成分，因此應(yīng)計算并評估雜質(zhì)對主成分量值的影響。

1.4 標準物質(zhì)制備

在(20±2)℃環(huán)境溫度下，采用重量–容量法配制氟喹諾酮類混合溶液標準物質(zhì)。分別準確稱量8種氟喹諾酮類藥物各約50 mg，置于同一500 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，振蕩、混勻，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg／L 的氟喹諾酮類混合溶液標準物質(zhì)。

將配制好的溶液標準物質(zhì)在(20±2)℃溫度下充分靜置，然后分裝至350 只2 mL 的潔凈棕色安瓿瓶中，分裝量為1.2 mL／瓶，編號后置于–18℃冰箱中冷凍保存。

1.5 均勻性檢驗

從已分裝好的溶液標準物質(zhì)中隨機抽取11 瓶樣品，按照1.2.1 中的色譜條件進行均勻性檢驗。以另一瓶獨立樣品為基準，每瓶樣品均重復(fù)測定3 次，測定順序隨機，取平均值作為測定結(jié)果，用方差分析法統(tǒng)計檢驗溶液標準物質(zhì)的均勻性。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

1.6.1 長期穩(wěn)定性

長期穩(wěn)定性一般要求在一定時間內(nèi)測量點不少于5 個，本研究分別在第0，1，3，6，7 個月隨機抽取2 瓶樣品，采用與均勻性檢驗相同的色譜條件，對每瓶樣品平行測定3 次，并采用新配制溶液進行單點法濃度定值，采用趨勢分析法對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行評估。

1.6.2 短期穩(wěn)定性

模擬標準物質(zhì)運輸?shù)膶嶋H情況，設(shè)定了4，20，50℃3 個不同的溫度條件進行短期穩(wěn)定性考察。分別在第1，3，5，7 d 隨機抽取2 瓶樣品，采用與長期穩(wěn)定性相同的方法對每瓶樣品平行測定3 次，采用趨勢分析法對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行評估。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料定性分析

2.1.1 高效液相色譜–質(zhì)譜法定性分析

采用高效液相色譜–質(zhì)譜法，在1.2.1 和1.2.2儀器工作條件下，對培氟沙星純品進行定性分析。培氟沙星液相色譜–質(zhì)譜離子峰如圖1 所示。

圖1 培氟沙星液相色譜–質(zhì)譜離子峰

由圖1 提供的離子碎片信息可知，培氟沙星譜圖中有3 個明顯的質(zhì)譜峰，質(zhì)荷比分別為m／z=334.1，m／z=316.1，m／z=290.3，經(jīng)過與培氟沙星分子式進行對比分析可知，3 個質(zhì)譜峰分別屬于[M+H]+，[M–OH+H]+，[M–COOH+H]+。此外，譜圖中其它信號峰響應(yīng)均較低。表明分析物為培氟沙星。

2.1.2 核磁氫譜法定性分析

在1.2.3 儀器工作條件下，對培氟沙星進行核磁共振氫譜分析，培氟沙星一維核磁氫譜圖見圖2。

圖2 培氟沙星一維核磁氫譜圖

經(jīng)相位校正和基線校正分析發(fā)現(xiàn)，圖中化學(xué)位移為1.50×10–6的峰為1 位置甲基上氫的特征峰，2.21×10–6的峰為N 相連甲基上氫的特征峰，2.73～3.50×10–6的峰為培氟沙星上含兩個N 的六元環(huán)上―CH2―位置上氫的特征峰，8.01×10–6的峰為F 旁邊CH 位置上氫的特征峰，9.02×10–6的峰是N 旁邊CH 位置上氫的特征峰。與檢索軟件得到的培氟沙星圖譜進行對比，兩圖譜中關(guān)鍵位置的特征峰化學(xué)位移均能一一對應(yīng)，表明分析物為培氟沙星。

2.2 原料定值分析

2.2.1 原料純度核驗

在1.2.1 和1.2.2 儀器工作條件下對培氟沙星進行色譜分析，采用色譜峰面積歸一化法測定培氟沙星的純度。在1.2.4儀器工作條件下，采用微波消解–電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定金屬元素含量，用卡爾費休水分儀測定水分含量。圖3 為培氟沙星的液相色譜圖，培氟沙星純度核驗結(jié)果見表3。

圖3 培氟沙星的液相色譜圖(總圖和局部放大圖)

表3 培氟沙星純度核驗結(jié)果 %

由表3 可知，實驗驗證的培氟沙星純度為92.20%，證書上給定的純度為92.19%，不確定度為±1%，培氟沙星核驗純度與證書上的標示值基本一致。因此可以采用原純品證書上的純度及不確定度。

2.2.2 原料互為雜質(zhì)分析

將每種氟喹諾酮類藥物配制成質(zhì)量濃度均為100 mg／L 的溶液，采用1.2.1（2）方法進行測定。通過色譜圖比較每種藥物中雜質(zhì)的保留時間是否與另外7 種主成分相同，以此判斷雜質(zhì)是否為另外7種主成分，并通過面積歸一化得到的百分含量計算其對其它主成分量值的影響，結(jié)果見表4。

表4 原料互為雜質(zhì)分析結(jié)果

由表4 可知，諾氟沙星和達氟沙星中含有恩諾沙星，含量分別為0.03%和0.23%，因此恩諾沙星的量值應(yīng)為100.26 mg／L，對于恩諾沙星的量值100 mg／L 幾乎沒有影響。恩諾沙星中有環(huán)丙沙星，但含量僅為0.07%，因此環(huán)丙沙星的量值應(yīng)為100.07 mg／L，對于環(huán)丙沙星的量值100 mg／L 幾乎沒有影響。

2.3 均勻性檢驗

按照1.5 方法對研制的氟喹諾酮混合溶液標準物質(zhì)進行均勻性檢驗，統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表5 均勻性檢驗方差分析結(jié)果

查表得F0.05(10，22)=2.30，由表5 可知，8 種氟喹諾酮類藥物的F值均小于F0.05(10，22)，即在95%置信范圍內(nèi)，研制的溶液標準物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物的量值在瓶間和瓶內(nèi)不存在顯著性差異，樣品均勻性良好。

2.4 穩(wěn)定性檢驗

2.4.1 長期穩(wěn)定性

按照1.6.1 方法進行長期穩(wěn)定性試驗，以檢測時間為自變量，以標準物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物含量為因變量進行線性回歸，計算8 種氟喹諾酮類藥物擬合直線的斜率|β1|、截距β0、標準偏差平方s2、斜率不確定度s(β1)，結(jié)果見表6。

表6 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

查表得t0.95，3=3.18，由表6 可知，8 種氟喹諾酮類藥物的|β1|值均小于t0.95，3s(β1)，表明直線斜率不顯著，研制的標準物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物在7個月內(nèi)的特征量值是穩(wěn)定的。

2.4.2 短期穩(wěn)定性

按照1.6.2 方法進行短期穩(wěn)定性試驗，以檢測時間為自變量，以標準物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物的含量為因變量進行線性回歸，計算8 種氟喹諾酮類藥物擬合直線的斜率|β1|、截距β0、標準偏差平方s2、斜率不確定度s(β1)，結(jié)果見表7。

表7 短期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表7 可知，在20℃運輸條件下8 種氟喹諾酮類藥物的|β1|值均小于t0.95，3s(β1)，表明直線斜率不顯著，研制的溶液標準物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物短期穩(wěn)定性良好，控制20℃以下的運輸條件，7 天內(nèi)量值穩(wěn)定。

2.5 不確定評定

氟喹諾酮混合溶液標準物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度主要包括溶液配制過程引入的不確定度、均勻性引入的不確定度和穩(wěn)定性引入的不確定度。

2.5.1 溶液配制過程引入的不確定度

溶液配制過程引入的不確定度主要包括原料純度、稱樣質(zhì)量和定容體積引入的不確定度。

原料純度引入的不確定度由原料證書獲得，結(jié)果見表8。

稱樣質(zhì)量引入的不確定度主要來自稱量的變動性和天平校正。可以通過天平的檢定證書獲得，天平重復(fù)性檢定結(jié)果分別為0.08 mg 和0.03 mg，假設(shè)正態(tài)分布，則換算成標準偏差后將兩項合成得稱樣質(zhì)量引入的標準不確定度，結(jié)果見表8。

將原料純度、稱樣質(zhì)量和定容體積引入的不確定度合成得溶液配制過程引入的相對標準不確定度，結(jié)果見表8。

表8 溶液配制過程引入的相對標準不確定度 %

2.5.2 均勻性引入的不確定度

均勻性引入的不確定度分量主要來源于標準物質(zhì)制備過程、分裝以及實驗分析間的偏差。標準物質(zhì)的不均勻性以獨立測量的平行試驗來表示，即以瓶間與瓶內(nèi)均勻性檢驗結(jié)果的相對標準偏差來表示。

式中：sH——瓶間標準偏差；

——組間方差；

——組內(nèi)方差；

n——組內(nèi)測量次數(shù)；

υ2——組內(nèi)自由度。

在這種情況下，sH等同于瓶間不均勻性引入的不確定度分量ubb，即公式ubb=sH。

將表5 中數(shù)據(jù)代入上式，計算得均勻性引入的不確定度，結(jié)果見表9。

2.5.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

根據(jù)ISO 導(dǎo)則35［19］，甲醇中8 種氟喹諾酮類藥物混合溶液標準物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度u1ts由式(3)計算：

式中：s(β1)——穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)擬合直線斜率的相 對標準不確定度；

t——給定的保存期限。

分別將表6 和表7 中數(shù)據(jù)代入式(3)，計算得長期、短期穩(wěn)定性引入的不確定度，結(jié)果見表9。

2.5.4 總不確定度

將上述各不確定度分量合成得氟喹諾酮混合溶液標準物質(zhì)總不確定度和擴展不確定度(k=2，取整數(shù))，結(jié)果見表9

表9 溶液標準物質(zhì)不確定評估結(jié)果 %

3 結(jié)語

以恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星7 種國家有證標準物質(zhì)和經(jīng)純度核驗后的培氟沙星純品為原料，采用重量–容量法制備了甲醇中8 種氟喹諾酮藥物混合溶液標準物質(zhì)。考察了8 種氟喹諾酮互為雜質(zhì)情況，利用高效液相色譜法進行了均勻性檢驗與穩(wěn)定性檢驗，對配制過程中產(chǎn)生的不確定度進行了系統(tǒng)的分析和評定。該混合溶液標準物質(zhì)已被批準為國家二級標準物質(zhì)，編號為GBW(E) 083598，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估中氟喹諾酮類藥物殘留測定提供了溯源保障。