朱婷芳 管 峰 苗 亮, 3 史雨紅, 3 陳 炯, 3

大彈涂魚()單核巨噬細胞低氧脅迫比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析*

朱婷芳1, 2管 峰2苗 亮2, 3史雨紅2, 3①陳 炯1, 2, 3①

(1. 寧波大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 寧波 315832; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室 寧波 315832; 3. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室 寧波 315832)

低氧是魚類在水生環(huán)境中的關(guān)鍵壓力之一。而大彈涂魚(, mudskipper)可能是少數(shù)能在低氧中自然呼吸的脊椎動物。本研究中, 我們分析了低氧脅迫8h后大彈涂魚頭腎源單核巨噬細胞(monocytes/macrophages, MO/MΦ)轉(zhuǎn)錄組變化。采用Illumina Hiseq 4000平臺進行高通量測序, 獲得了大彈涂魚MO/MΦ短時低氧脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 并將獲得的原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI獲得ID號: SRR9771486—SRR9771491 (Bioproject PRJNA543702)。分析結(jié)果顯示,<0.05和|log2(fold change)| ≥ 1條件下進行差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選, 低氧處理組中共獲得4487個DEGs, 包括2507個上調(diào)DEGs, 1980個下調(diào)DEGs。其中低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors,)轉(zhuǎn)錄本的表達無顯著變化, 而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor-A,)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,)基因轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)?；虮倔w(Gene Ontology, GO)注釋以及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信號通路富集分析揭示了糖酵解/糖異生和氧化磷酸化可能在MO/MΦ應(yīng)對短時低氧脅迫中具有重要作用。隨機選擇10個DEGs進行實時熒光定量PCR驗證, 上述基因表達變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。本研究揭示了在短時低氧脅迫下大彈涂魚MO/MΦ基因表達及信號通路調(diào)控機制。

低氧脅迫; 基因表達; 信號通路; 比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析; 大彈涂魚

對大多數(shù)生物體來說, 氧氣是必不可少的, 因此, 生物體中氧的吸收和代謝受嚴格控制。然而, 環(huán)境、病理以及生理條件變化均可導(dǎo)致氧氣供應(yīng)減少(Van Der Meer, 2005)。與陸地環(huán)境相比, 水環(huán)境中溶解氧含量變化劇烈(Bickler, 2007)。因此, 與哺乳動物和鳥類相比, 魚類更能適應(yīng)溶解氧含量的變化(Xiao, 2015)。低氧脅迫可影響魚類的行為、生長、攝食、性別和生理狀態(tài)(Foss, 2002; Robertson, 2014; Abdel-Tawwab, 2015)。而且, 魚類細胞也可感知和傳導(dǎo)低氧脅迫信號, 通過基因表達調(diào)控改變生化反應(yīng), 從而響應(yīng)低氧脅迫(Terova, 2008)。復(fù)雜的生化反應(yīng)包括血糖濃度降低、糖有氧氧化等代謝反應(yīng)抑制、乳酸積累、紅細胞壓積、血紅蛋白O2親和力以及無氧呼吸增加(Jensen, 1993; Virani, 2000; Cadiz, 2018)。在轉(zhuǎn)錄水平, 響應(yīng)低氧脅迫的基因包括低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors,)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor-A,)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,)、促紅細胞生成素(erythropoietin,)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter,)等基因。HIF是一種主要由低氧誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的重要的轉(zhuǎn)錄因子, 介導(dǎo)基因表達的變化, 從而在維持動態(tài)氧平衡中發(fā)揮著重要作用(Semenza, 1999)。VEGF-A是一種具有血管通透性的蛋白, 可刺激血管生成, 增加O2供應(yīng)(Zhong, 2009; Shibuya, 2011)。GAPDH是糖酵解通路的關(guān)鍵酶, 催化3-磷酸甘油醛+NAD++Pi反應(yīng)生成1,3-二磷酸甘油酸+NADH+H+(Chiche, 2015)。EPO是低氧脅迫誘導(dǎo)的與紅細胞生成有關(guān)的蛋白(Xiao, 2015)。GLUT是低氧誘導(dǎo)的促進細胞葡萄糖攝取的蛋白(Zhang, 2003)。這些重要基因往往也是氧傳感通路(oxygen-sensing pathway)中的關(guān)鍵成員。氧傳感通路包括HIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)、哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)、未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)和核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)等(Wouters, 2008; Majmundar, 2010; Xiao, 2015)。上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)通過激活轉(zhuǎn)錄和抑制翻譯等方式促進動物響應(yīng)和適應(yīng)低氧脅迫(Wouters, 2008; Majmundar, 2010)。

大彈涂魚(, mudskipper)主要分布在中國和日本的潮間帶(Chen, 2015; 梁亞芳等, 2018)。大彈涂魚構(gòu)建的洞穴含水量較低, 水環(huán)境中經(jīng)常出現(xiàn)低氧情況, 可能是少數(shù)在低氧環(huán)境中自然呼吸的脊椎動物(Aguilar, 2000)。由于其特殊的生理特性, 使其成為研究低氧脅迫對魚類的影響以及魚類響應(yīng)低氧脅迫機制較為合適的動物模型。研究魚類的低氧響應(yīng)機制, 不僅有助于我們了解低氧信號通路的進化, 而且對耐低氧魚類物種/品系的選育也具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康大彈涂魚, 體重30—40g/尾, 購自浙江省寧波市路林市場。暫養(yǎng)期間水溫為(24±1)°C, 鹽度為10, 不間斷充氣, 每天投喂飼料一次, 每天換水50%。實驗室條件下暫養(yǎng)兩周, 并選擇全身無病癥的魚進行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 大彈涂魚頭腎源單核巨噬細胞(monocytes/ macrophages, MO/MФ)的原代培養(yǎng) 用丁香酚(Eugenol)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司, 上海)麻醉大彈涂魚, 取血后采集頭腎。大彈涂魚MO/MФ的分離培養(yǎng)參考本實驗室已建立的方法(Ding, 2019), 采用Ficoll-Paque Premium (GE healthcare, 美國)密度梯度離心方法分離細胞, 獲得含有MO/MΦ的白色細胞混懸層。用RPMI 1640培養(yǎng)基洗去未貼壁細胞, 重復(fù)2次, 用完全培養(yǎng)基(RPMI 1640、5%胎牛血清、5%大彈涂魚血清和1%青霉素/鏈霉素) 24°C繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞。經(jīng)Giemsa′s染色后鏡檢細胞的形態(tài), 確認超過95%貼壁細胞屬于MO/MΦ。

1.2.2 低氧脅迫處理大彈涂魚MO/MΦ 參考已發(fā)表論文, 大彈涂魚MO/MФ置于細胞培養(yǎng)小室(Billups-Rothenberg, 美國) 24°C培養(yǎng)(Guan, 2017)。將大彈涂魚MO/MФ隨機分為2組: 常氧處理組(Z組) (21% O2, 5% CO2, 4% N2)和低氧處理組 (D組) (1% O2, 5% CO2, 94% N2), 每組3個平行實驗, 各組處理8h。處理結(jié)束后清洗細胞立即置于液氮中冷凍, ?80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大彈涂魚MO/MΦ轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和測序 用RNAiso試劑(Invitrogen, 上海)方法根據(jù)說明書提取大彈涂魚MO/MΦ的總RNA。采用Illumina Hiseq 4000 (聯(lián)川生物技術(shù)有限公司, 杭州)進行測序。每個樣本取出5μg總RNA, 使用Oligo(dT)磁珠(Invitrogen)進行兩輪純化, 對其中帶有多聚腺苷酸(PolyA)的mRNA進行特異性捕獲。將捕獲到的mRNA在高溫條件下利用二價陽離子進行片段化。將片段化的RNA基于Illumina RNA連接法(Illumina, 美國)合成cDNA。在Illumina Hiseq 4000平臺按照標準程序進行測序, 讀長150bp。常氧處理組和低氧處理組各3個生物學(xué)重復(fù)均同時進行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)分析 在 Illumina Hiseq 4000平臺獲得原始序列(Raw data), 在RSeQC (2.4)中檢測Raw data的質(zhì)量, 在FastQC (0.10.1)中去除帶接頭(Adaptor)的reads, 含有N (N表示無法確定堿基信息)的比例大于5%的reads和低質(zhì)量reads (質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個reads的20%以上), 得到Clean data。利用HISAT (Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts) (2.0)軟件將大彈涂魚MO/MΦ各個文庫的Clean data分別與現(xiàn)有的大彈涂魚全基因組序列比對。參考基因和基因組注釋文件下載自NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ assembly/GCA_000788275.1/)。String Tie (1.3.0)軟件用于read比對組裝, Ballgown軟件用于差異分析。將每個Clean data序列的數(shù)目標準化為FPKM (fragments per kilobase of exon model per million mapped reads), 用以代表該基因的表達水平, 在<0.05和|log2(fold change)|≥1條件下(fold change: 差異倍數(shù), FC)篩選兩個樣本之間的DEGs。

1.2.5 基因的功能注釋 依據(jù)非冗余(Non- redundant, Nr)數(shù)據(jù)庫中的注釋信息, 將大彈涂魚參考基因組轉(zhuǎn)錄本序列分別與基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO) (http://geneontology.org)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) (www.genome.jp/kegg)數(shù)據(jù)庫進行BlastX比對, 設(shè)置E-value為1E-5, 保留每個基因比對到的所有的GO term和KEGG 通路, 從而獲得每個基因的GO和KEGG注釋并使用軟件GOseq(1.18.0)和KOBAS軟件對差異基因進行GO、KEGG富集。

1.2.6 實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)隨機選擇10個DEGs, 用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物(表1), 進行qRT-PCR分析。將各樣品進行3次生物學(xué)重復(fù)的RNA采用第一鏈cDNA合成試劑盒(Promega, 美國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以此為模板, 18S基因為內(nèi)參, 采用TaKaRa公司的SYBR Green RT-PCR試劑盒, 利用Light Cycler 480 (Roche, 瑞士)進行熒光定量檢測。各樣品的每個基因重復(fù)4次, 按2–DDCt相對定量法計算相對表達量。反應(yīng)體系為20.0μL (cDNA模板1.0μL, 上下游引物各1.0μL, SYBR Green染料12.5μL, 無菌去離子水9.5μL)。擴增程序為: 95°C預(yù)變性5min, 95°C變性30s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s, 變性至延伸共40個循環(huán); 熔解曲線94°C 30s, 72°C 60s, 95°C 30s。所有數(shù)據(jù)均以標準平均誤(standard error of the mean,)表示(Chen, 2019)。

表1 qRT-PCR實驗中所用DEGs及其qRT-PCR引物的信息

注：: 凋亡蛋白;: 血管內(nèi)皮生長因子A;: 端粒結(jié)合蛋白;: 鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2;: 3-磷酸甘油醛脫氫酶;: 通用轉(zhuǎn)錄因子3A;: 線粒體核糖體蛋白L53;: 跨膜蛋白144;: 胰島素降解酶;: 硫酸軟骨素磺基轉(zhuǎn)移酶;: 內(nèi)參基因

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

本研究以三組常氧處理組和三組低氧處理組的大彈涂魚MO/MΦ總RNA為模板, 構(gòu)建了6個cDNA文庫。利用Illumina Hiseq 4000分別對大彈涂魚MO/MΦ常氧處理組和低氧處理組進行了轉(zhuǎn)錄組測序。原始數(shù)據(jù)上傳至 NCBI Short Read Archive (SRA), 登錄號分別為SRR9771486—SRR9771491 (Bioproject PRJNA543702)。常氧處理組平均獲得46321325 個Clean reads, 可比對到參考基因組reads數(shù)目平均為41186267個, 占所有reads的88.89%。堿基質(zhì)量及組成分析顯示, 每組GC含量區(qū)間為47.00%—48.50%, 各樣品Q30的堿基質(zhì)量值比例均不小于95.40% (表2); 低氧處理組平均獲得52155548個 Clean reads, 可比對到參考基因組reads數(shù)目平均為47405512個, 占所有reads的90.85%, 堿基質(zhì)量及組成分析顯示, 每組GC含量區(qū)間為46.00%—46.50%, 各樣品Q30的堿基質(zhì)量值比例均不小于94.55% (表2)。

參照大彈涂魚全基因組轉(zhuǎn)錄本信息, 在<0.05和|log2(FC)|≥1條件下, 低氧處理組共獲得4487個DEGs (圖1a)。其中上調(diào)DEGs有2507個, 下調(diào) DEGs有1980個(圖1b)。

注： a. 火山圖, 紅色點指示上調(diào)的DEGs; 藍色點指示下調(diào)的DEGs; 灰色點指示表達差異不顯著的基因; b. DEGs數(shù)量統(tǒng)計

2.2 DEGs的GO和KEGG注釋和富集分析

在低氧處理組中, 上調(diào)DEGs的GO富集分析結(jié)果顯示, 共931個基因獲得GO功能注釋, 包括678個分子功能(molecular function) (34.24%)、308個細胞組分(cellular component) (15.56%)、994個生物過程(biological process) (50.20%)。下調(diào)DEGs的GO富集分析結(jié)果顯示, 共662個基因獲得GO功能注釋, 包括674個分子功能(molecular function) (37.99%)、221個細胞組分(cellular component) (12.46%)、879個生物過程(biological process) (49.55%)。各選取3個類別中上調(diào)或下調(diào)DEGs最多的10個GO節(jié)點(圖2)。

上調(diào)基因中, 排列前三的分子功能類型為翻譯(translation)、氧化還原過程(oxidation-reduction process)、DNA復(fù)制(DNA replication), 數(shù)目分別是43、42、25個; 排列前三的細胞組分類型為細胞核(nucleus)、線粒體(mitochondrion)、細胞溶質(zhì)(cytosol), 數(shù)目分別為144、51、45個; 排列前三的生物過程類型為核糖體的結(jié)構(gòu)成分(structural constituent of ribosome)、RNA結(jié)合(RNA binding)、poly(A) RNA結(jié)合(poly(A) RNA binding), 數(shù)目分別是55、32、15個。下調(diào)基因中, 排列前三的分子功能類型為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction) 、DNA依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控(regulation of transcription, DNA-templated)、蛋白質(zhì)水解(proteolysis), 數(shù)目分別是28、28、25個; 排列前三的細胞組分類型為膜的整體成分(integral component of membrane) 、膜(membrane)、細胞質(zhì)(cytoplasm), 數(shù)目分別是174、173、88個; 排列前三的生物過程類型為金屬離子結(jié)合(metal ion binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding), 數(shù)目分別是66、48、42個。

表2 6組大彈涂魚MO/MΦ轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計

Tab.2 Statistics of sequencing data of 6 transcriptomes of mudskipper MO/MΦ

注： Q30: 質(zhì)量值≥30的堿基所占百分比

具有注釋的上調(diào)DEGs有500個, 涉及206條KEGG通路; 具有注釋的下調(diào)DEGs有357個, 涉及211條KEGG通路相關(guān)。選取的上調(diào)DEGs前30條顯著富集的代謝通路(圖3a)。包括核糖體(ribosome)、DNA復(fù)制(DNA replication)、錯配修復(fù)(mismatch repair)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、核酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair)、細胞周期(cell cycle)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、同源重組(Homologous recombination)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等通路。選取的下調(diào)DEGs前30條顯著富集的代謝通路(圖3b)。下調(diào)DEGs涉及包括沙門氏菌感染(salmonella infection)、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成(glycosylphosphatidylinositol-anchor biosynthesis)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、N-聚糖生物合成(N-Glycan biosynthesis)、胞吞(endocytosis)、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ABC transporters)等通路。

圖2 大彈涂魚 MO/MΦ低氧處理組上、下調(diào)DEGs的GO分析

注： GO分為三類: 細胞成分、分子功能和生物學(xué)過程?？v坐標表示主類中的不同亞類基因數(shù)量, 橫坐標表示基因分類。a. 上調(diào)差異基因。1: DNA復(fù)制起始; 2: 細胞質(zhì)翻譯; 3: 來自三順反子rRNA轉(zhuǎn)錄本的SSU-rRNA的成熟(SSU-rRNA, 5.8S rRNA, LSU-rRNA); 4: 細胞周期; 5: 細胞對DNA損傷刺激的反應(yīng); 6: 甲基化; 7: DNA修復(fù); 8: DNA復(fù)制; 9: 氧化還原過程; 10: 翻譯; 11: 核糖體; 12: 細胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物; 13: 線粒體內(nèi)膜; 14: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜; 15: 胞質(zhì)小核糖體亞基; 16: 胞質(zhì)大核糖體亞基; 17: 核仁; 18: 細胞溶質(zhì); 19: 線粒體; 20: 細胞核; 21: FK506結(jié)合; 22: RNA聚合酶III活性; 23: DNA解旋酶活性; 24: DNA鉗裝載器活性; 25: mRNA結(jié)合; 26: 解旋酶活性; 27: 肽酰-脯氨酰順反式異構(gòu)酶活性; 28: poly(A)RNA結(jié)合; 29: RNA結(jié)合; 30: 核糖體的結(jié)構(gòu)成分。b. 下調(diào)差異基因。1: DNA依賴性轉(zhuǎn)錄; 2: 代謝過程; 3: 跨膜轉(zhuǎn)運; 4: 轉(zhuǎn)運; 5: 磷酸化; 6: 蛋白質(zhì)磷酸化; 7: 氧化還原過程; 8: 蛋白質(zhì)水解; 9: DNA依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控; 10: 信號轉(zhuǎn)導(dǎo); 11: 高爾基體; 12: 細胞溶質(zhì); 13: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 14: 線粒體; 15: 質(zhì)膜; 16: 質(zhì)膜的整體成分; 17: 細胞核; 18: 細胞質(zhì); 19: 膜; 20: 膜的整體成分; 21: DNA結(jié)合; 22: 激酶活性; 23: 氧化還原酶活性; 24: 蛋白結(jié)合; 25: 水解酶活性; 26: 轉(zhuǎn)移酶活性; 27: 核苷酸結(jié)合; 28: 鋅離子結(jié)合; 29: ATP結(jié)合; 30: 金屬離子結(jié)合

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果

從轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中隨機挑選10個DEGs, 通過實時熒光定量PCR相對定量法檢測其在低氧處理組與常氧處理組中的表達差異, 并與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進行比較(圖4)。基因、、、、、、、、和10條DEGs在低氧處理后的變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組中基因表達分析結(jié)果一致, 證明了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的真實性和可靠性。

3 討論

低氧是一種重要的環(huán)境壓力源, 影響水生生物的生存、繁殖、生長和發(fā)展, 進而對整個水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠影響(Shang, 2004)。許多魚類能夠在轉(zhuǎn)錄水平上運作一套復(fù)雜的分子戰(zhàn)略來響應(yīng)低氧脅迫(Gracey, 2001; van Der Meer, 2005; Zhong, 2009)?；蛞驯还J為低氧信號通路的主要調(diào)節(jié)因子;基因在維持動態(tài)氧平衡和調(diào)節(jié)低氧條件下氧濃度的變化方面發(fā)揮著重要作用(Xiao, 2015)。低氧脅迫120d致使團頭魴(, blunt snout bream)的不同組織中基因mRNA表達增加(Li, 2015)。低氧脅迫1h后, 河鱸(, Eurasian perch)腦和肝臟中基因的表達增加, 低氧脅迫15d后, 肌肉中基因表達顯著增加, 腦和肝臟中基因的表達變化不顯著(Rimoldi, 2012)。印度鯰魚(, Indian catfish)低氧脅迫1h或6h后, 腦、肝和頭腎中和基因表達顯著增加, 而在自然條件下的長期低氧脅迫下, 脾臟基因表達顯著增加, 肌肉基因表達顯著增加(Mohindra, 2013)。但研究發(fā)現(xiàn), 其他魚類中基因的表達方式并不一致。低氧脅迫處理72h后, 花斑裸鯉(, piebald naked carp)多個組織中基因均未檢測到顯著變化(Qi, 2018)。此外, 低氧脅迫1.5h后, 斑點叉尾鮰(, channel catfish)大部分組織中基因表達顯著降低; 而低氧脅迫5h后,基因表達顯著增加(Geng, 2014)。HIF-1可通過與HIF-1靶基因啟動子和增強子區(qū)的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response elements, HREs)結(jié)合, 激活靶基因的轉(zhuǎn)錄表達以響應(yīng)低氧脅迫, 如基因(Nikinmaa, 2005)。VEGF-A蛋白通過結(jié)合和激活VEGFR-1 (VEGF receptor-1)和VEGFR-2, 促進血管生成、血管通透性、細胞遷移和基因表達(Shibuya, 2011)。低氧脅迫7d誘導(dǎo)點帶石斑魚(, orange-spotted grouper)基因的表達, 而該基因的表達有利于氧輸送增加(Yu, 2008)。低氧脅迫誘導(dǎo)眼斑星麗魚(, cichlid fish) 3h, 肝臟基因的表達顯著增加(Baptista, 2016)。雖然基因是HIF-1的靶向基因, 但低氧脅迫時基因的表達也可激活NF-κB和HIF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 進而導(dǎo)致VEGF-A蛋白的分泌增加; 此外, GAPDH蛋白與RNA結(jié)合的能力在一定程度上也可以穩(wěn)定或的mRNA表達(Chiche, 2015)。尼羅羅非魚(, Nile tilapia)低氧脅迫12h后, 心臟基因表達顯著增加(Xia, 2018)。本研究中, 低氧脅迫大彈涂魚MO/MΦ 8h, 轉(zhuǎn)錄組DEGs分析顯示,基因轉(zhuǎn)錄本的表達無顯著變化, 而和基因表達上調(diào)。

注： 富集因子=在路徑中富集的DEGs的數(shù)量/背景基因集中所有基因的數(shù)量。每個氣泡的大小和顏色分別代表在路徑中富集的DEGs的數(shù)量和富集的意義。a. 上調(diào)差異基因。1: 泛醌和其他萜醌生物合成; 2: 甾體生物合成; 3: 剪接體; 4: RNA轉(zhuǎn)運; 5: RNA聚合酶; 6: 核糖體; 7: 嘧啶代謝; 8: 嘌呤代謝; 9: p53信號通路; 10: 氧化磷酸化; 11: 葉酸碳庫; 12: 核苷酸切除修復(fù); 13: 氮代謝; 14: 錯配修復(fù); 15: 同源重組; 16: 造血細胞系; 17: 乙醛酸和二羧酸代謝; 18: 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; 19: 谷胱甘肽代謝; 20: 脂肪酸延長; 21: 范可尼貧血途徑; 22: 藥物代謝-其他酶; 23: 藥物代謝-細胞色素P450; 24: DNA復(fù)制; 25: 細胞溶質(zhì)DNA傳感途徑; 26: 細胞周期; 27: 碳代謝; 28: 氨基酸生物合成; 29: 堿基切除修復(fù); 30: 精氨酸和脯氨酸代謝。b. 下調(diào)差異基因。1: 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解; 2: 沙門氏菌感染; 3: 腎細胞癌; 4: PPAR信號通路; 5: 磷脂酶D信號通路; 6: 噬菌體; 7: 戊糖與葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化; 8: 癌癥的途徑; 9: 胰腺癌; 10: N-聚糖生物合成; 11: 黑色素生成; 12: MAPK信號通路; 13: 溶酶體; 14: 長壽調(diào)節(jié)途徑-哺乳動物; 15: 胰島素信號通路; 16: GnRH信號通路; 17: 糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成; 18: 糖胺聚糖生物合成-硫酸角蛋白; 19: 糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素; 20: 糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素; 21: 甘油脂代謝; 22: 脂肪酸代謝; 23: 脂肪酸降解; 24: 胞吞; 25: 背腹軸形成; 26: 結(jié)直腸癌; 27: 抗壞血酸和新陳代謝; 28: AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用; 29: 急性髓系白血病; 30: ABC轉(zhuǎn)運蛋白

注： 1:; 2:; 3:; 4:; 5:; 6:; 7; 8:; 9:; 10:; 內(nèi)參基因:;=4

功能注釋可將基因分成功能相關(guān)的基因群或歸入不同的通路, 可根據(jù)基因群的重要性排序, 借助高通量技術(shù)快速揭開其中的生物學(xué)機制(Xia, 2018)。據(jù)文獻報道, 魚類在應(yīng)對短時低氧脅迫時, 氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、糖酵解(glycolysis)和糖原分解(glycogenolysis)通路相關(guān)基因表達量顯著增加, 顯示通過糖類物質(zhì)分解和氧化磷酸化作為獲取能量主要方式, 氧化磷酸化反應(yīng)增加是低氧的早期反應(yīng), 有可能是利于維持ATP的穩(wěn)定(Everett, 2012)。而在長期低氧脅迫中, 脂質(zhì)分解(lipolysis)則作為能量供應(yīng)的主要來源(Li, 2018)。低氧脅迫長頜姬鰕虎魚(, long-jawed mudsucker) 8h、24h、72h和144h, 心肌的氧化磷酸化通路中的細胞色素氧化酶I基因(cytochrome oxidase subunit I,)表達有不同程度的增加; 骨骼肌中, 細胞色素b (cytochrome b,)和基因表達也顯著增加, 而在肝臟中這兩個基因未顯著變化, 但肝臟中糖酵解通路相關(guān)基因表達顯著上調(diào)并且隨著脅迫時間的延長而繼續(xù)增加(Gracey, 2001)。低氧脅迫大底鳉(, gulf killifish) 4h的肝臟和96h的心臟中氧化磷酸化通路相關(guān)基因表達顯著增加, 包括復(fù)合物I (NADH脫氫酶) (NADH dehydrogenase,)和復(fù)合物IV(細胞色素C氧化酶) (cytochrome coxidase,) 的不同亞基基因的表達顯著增加(Everett, 2012)。低氧脅迫5d后, 日本青鳉(, medaka)鰭中糖酵解和氧化磷酸化通路相關(guān)基因表達增加(Zhang, 2012)。低氧脅迫72h后, 花斑裸鯉()的肌肉中糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)通路的相關(guān)基因表達增加(Qi, 2018)。低氧脅迫2d、4d、7d后, 草魚(, grass carp)鰓組織中糖酵解途徑相關(guān)蛋白表達增加(Xu, 2019)。低氧脅迫6h后, 雜交斑紋鱸(×, striped bass × white bass)肝臟中脂肪酸代謝和脂蛋白代謝相關(guān)基因有明顯下調(diào)(Beck, 2016)。低氧脅迫6h或12h后, 尼羅羅非魚幼魚心臟或成魚肝臟的糖酵解/糖異生通路和脂肪酸代謝通路的相關(guān)基因表達均增加(Li, 2018; Xia, 2018)。低氧脅迫4周后, 尼羅羅非魚肝臟中糖異生和脂質(zhì)分解通路相關(guān)基因表達上調(diào), 而糖酵解和脂質(zhì)的合成通路相關(guān)基因表達下調(diào)(Li, 2018)。但也有例外, 如斑馬魚(, zebrafish)低氧脅迫3周后, 鰓中糖酵解通路相關(guān)基因表達增加, 氧化磷酸化通路(包括 12個亞基基因下調(diào), 2個亞基基因下調(diào))以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達降低(Van Der Meer, 2005 )。本研究中低氧脅迫大彈涂魚的MO/MΦ 8h后, 氧化磷酸化通路中有19個基因表達顯著上調(diào), 如細胞色素復(fù)合物(cytochrome b-c1,)、、、ATP合酶(ATP synthase)部分亞基轉(zhuǎn)錄本增加。此外, 低氧處理組糖酵解/糖異生通路中、磷酸果糖激酶(肌肉)(phosphofructokinase, muscle,)、果糖二磷酸醛縮酶B (fructose-bisphosphate aldolase B,)等6個基因轉(zhuǎn)錄本上調(diào)。而脂類代謝相關(guān)通路(甘油脂代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸降解)相關(guān)基因表達顯著下降。這與上述多數(shù)魚類中低氧脅迫后mRNA或蛋白表達分析一致。

根據(jù)上述分析, 本研究大彈涂魚MO/MΦ短時低氧脅迫后, DEGs、GO以及KEGG富集分析結(jié)果與其他魚類存在差異。低氧脅迫造成基因表達差異可能與物種有關(guān)(Qi, 2018)。漲潮或冬天, 大彈涂魚會躲避在洞穴中, 而在洞穴中會經(jīng)歷低氧脅迫(Toba, 2014)。大彈涂魚在洞穴低氧脅迫8h時, 不需進行無氧代謝并且不受到乳酸積累的影響(Toba, 2014)。此外, 魚類在低氧脅迫條件下所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)具有組織特異性(Richards, 2009)。而且適當?shù)牡脱趺{迫可能改變魚類頭腎甚至是分離的MO/MΦ的免疫反應(yīng)(Kvamme, 2013)。

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究采用有參轉(zhuǎn)錄組分析方法揭示了在短時低氧脅迫下大彈涂魚MO/MΦ基因表達及信號通路調(diào)控機制, 低氧誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄本的表達無顯著變化, 血管內(nèi)皮生長因子以及3-磷酸甘油醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)。揭示了糖酵解/糖異生和氧化磷酸化可能在MO/MΦ應(yīng)對短時低氧脅迫中具有重要作用, 為魚類在低氧條件下的響應(yīng)機制提供了新的見解。

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COMPARATIVE TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF MO/MΦ IN RESPONSE TO LOW OXYGEN STRESS IN MUDSKIPPER

ZHU Ting-Fang1, 2, GUAN Feng2, MIAO Liang2, 3, SHI Yu-Hong2, 3, CHEN Jiong1, 2, 3

(1. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2.Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology,School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315832, China; 3. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315832, China)

Hypoxia is one of the key pressures of fish in aquatic environment. And mudskipper () might be one of a few vertebrates that naturally respire hypoxic air. Therefore, the expression changes of head kidney-derived monocytes/macrophages (MO/MΦ) transcripts in mudskipper were analyzed under hypoxia stress for 8h. Using Illumina Hiseq 4000 platform for high-throughput sequencing, the complete transcriptome data of mudskipper MO/MΦ were obtained, and uploaded to National Center for Biotechnology Information (NCBI) with the accession number of SRR9771486—SRR9771491 (Bioproject PRJNA543702). Results show that a total of 4487 differentially expressed genes (DEGs) with 2507 up-regulated DEGs, and 1980 down-regulated DEGs were obtained in hypoxia group, screening under the condition of<0.05 and |log2(fold change)| ≥ 1. There was no significant change in the expression of hypoxia inducible factor () transcripts, but significant upregulation in the expression of vascular endothelial growth factor () and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase () transcripts. The Gene Ontology (GO) annotation and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome (KEGG) signal pathway enrichment analysis revealed that glycolysis/gluconeogenesis and oxidative phosphorylation might play important roles in short-term hypoxia stress on MO/MΦ. Ten differentially expressed genes were randomly selected for quantitative real-time PCR (qRT-PCR) verification, and the trend was consistent with that of the transcriptome analysis. Finally, the regulation of gene expressions and the signal pathways in mudskipper MO/MΦ responding to short-term hypoxia stress have been revealed.

hypoxia stress; gene expression; signal pathway; comparative transcriptome analysis;

* 國家自然科學(xué)基金項目, 31772876號, 31402323號; 寧波市科技創(chuàng)新團隊項目, 2015C110018號; 寧波市自然科學(xué)基金項目, 2018A610225號; 寧波市科技富民項目, 2017C10037號。朱婷芳, 碩士研究生, E-mail: 17855828736@163.com

史雨紅, 碩士生導(dǎo)師, 副教授, E-mail: shiyuhong0517@163.com; 陳 炯, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: jchen1975@163.com

2019-11-22,

2019-12-27

S917

10.11693/hyhz20191100223