王思蘄 曹小勇 胡選萍 秦公偉 趙垚

摘要：以建蘭不同發(fā)育狀態(tài)種子為材料，通過無菌播種的方法，研究種子成熟度（授粉后60d、90d、180d、270d、360d、480d的種子，下文授粉后天數(shù)用DAP表示），液體與固體培養(yǎng)方式以及植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，NAA等因素對種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：DAP60種子未萌發(fā)，DAP90、DAP180、DAP270種子的萌發(fā)率高于DAP360、DAP480種子;液體培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率為39.56%高于固體培養(yǎng)基萌發(fā)率23.47%;6-BA與NAA都可促進(jìn)建蘭種子萌發(fā)，且萌發(fā)率隨著激素濃度增加而升高，種子在1/2MS+6-BA 2mg/L中萌發(fā)率達(dá)到96.27%，且萌發(fā)指數(shù)優(yōu)于NAA及其它濃度6-BA。

關(guān)鍵詞：建蘭;種子成熟度;固液培養(yǎng);6-BA;NAA

中圖分類號：S-3? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200229007

建蘭（Cymbidium ensifolium），又名四季蘭，為蘭科蘭屬多年地生草本植物，生于海拔600～1800m的山谷、疏林、灌叢或草叢中，廣泛分布于東南亞和南亞各國。我國主要產(chǎn)地有浙江、福建、廣東、海南等。葉片寬1cm左右，長40～60cm，形狀如劍，花多葶長，花清香，花梗和花瓣多數(shù)為淡黃色，唇瓣上有暗點(diǎn)紫塊，在我國有悠久的栽培歷史[1，2]。

建蘭單個(gè)蒴果內(nèi)具有大量種子，和其它蘭科植物相似其種子細(xì)小，無胚乳，種子發(fā)育緩慢，萌發(fā)率低[3-5]。目前，對建蘭組織培養(yǎng)研究主要在莖尖與側(cè)芽誘導(dǎo)原球莖[6-9]、根狀莖增殖與分化[10-12]、花芽誘導(dǎo)[13]、遺傳多樣性分析[14，15] 等方面。同時(shí)，建蘭不同種子成熟度與萌發(fā)率的關(guān)系未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過研究建蘭種子成熟度、液體與固體培養(yǎng)方式、植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA及NAA對萌發(fā)的影響，確定適合建蘭種子萌發(fā)的培養(yǎng)基，以提高種子萌發(fā)率，為推進(jìn)建蘭離體培養(yǎng)的效率提供技術(shù)支持。

1材料和方法

1.1材料

建蘭植株培養(yǎng)于陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，2017年9月—2018年6月盛花期進(jìn)行人工授粉，2019年1月8日首個(gè)果實(shí)開裂成熟，從授粉到果實(shí)成熟需要約480d。選取DAP60、DAP90、DAP180、DAP270、DAP360、DAP480的無菌種子用于不同成熟度種子萌發(fā)的培養(yǎng)，DAP360用于液體、固體培養(yǎng)基與不同濃度6-BA、NAA培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件

采用液體、固體培養(yǎng)方式，以30mL的玻璃螺口頂空瓶為培養(yǎng)容器，每瓶內(nèi)培養(yǎng)基約為10～15mL，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度25±1℃，種子激素處理暗培養(yǎng)，其他處理光照強(qiáng)度1000～2000Lx，光照12h/d。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1建蘭果實(shí)消毒

果實(shí)采收后，去除干枯花瓣，用毛筆粘上肥皂刷洗果皮，流水沖洗2h后移入超凈工作臺，用75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒15min，無菌水清洗3次，在無菌培養(yǎng)皿中切去多余果柄、干枯合蕊柱后，切分果實(shí)，得到的種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.3.2不同成熟度種子培養(yǎng)

以1/2MS液體培養(yǎng)基為萌發(fā)培養(yǎng)基。分別將不同發(fā)育時(shí)期的無菌種子均勻播種至培養(yǎng)基內(nèi)150d后，統(tǒng)計(jì)各時(shí)期種子萌發(fā)（萌發(fā)為種子發(fā)育至下文B階段）數(shù)量。

1.3.3液體、固體培養(yǎng)

將無菌種子均勻播種于1/2MS固體、液體培養(yǎng)基中360d后，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子數(shù)量。固體培養(yǎng)基中添加7g/L瓊脂，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂。每瓶種子數(shù)量約為70～200粒。

1.3.4不同濃度6-BA與NAA培養(yǎng)

將無菌種子均勻播種于以下7種液體培養(yǎng)基中：（A1）：1/2MS（對照組）; （A2）：1/2MS+0.1mg/L 6-BA;（A3）：1/2MS+1mg/L 6-BA;（A4）：1/2MS+2mg/L 6-BA;（A5）：1/2MS+0.1mg/L NAA;（A6）：1/2MS+1mg/L NAA;（A7）：1/2MS+2mg/L NAA。培養(yǎng)360d后，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)量。每瓶種子數(shù)量約為70～200粒。

1.4萌發(fā)指標(biāo)計(jì)量

萌發(fā)率=B+C+D+EA+B+C+D+E×100%

萌發(fā)指數(shù)=10B+20C+30D+40EA+B+C+D+E×100%

ABCDE分別表示建蘭種子萌發(fā)過程5個(gè)階段（未萌動、膨大、突破種皮、伸長、分叉）。

A：種胚未萌動，胚的長度小于0.19cm;

B：種胚膨大但未突破種皮，胚的長度0.19～0.23cm;

C：原球莖突破種皮，原球莖長度0.24～0.35cm;

D：根狀莖大部分已突破種皮或與種皮分離，此階段許多根狀莖變成綠色，長度大于0.35cm;

E：一個(gè)根狀莖上的分叉數(shù)量大于1。

通過對種子萌發(fā)各階段數(shù)量統(tǒng)計(jì)，得到萌發(fā)指數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和Prism 5對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1種子成熟度對萌發(fā)的影響

建蘭種子的成熟度顯著影響種子的萌發(fā)數(shù)量，成熟度低以及完全成熟的種子萌發(fā)數(shù)量均較低。DAP60的蒴果瘦小，其寬度與DAP90-480蒴果存在明顯差異，解剖蒴果種子白色，細(xì)小，緊貼于胎座組織，在培養(yǎng)基上未萌發(fā);DAP90種子白色，細(xì)小，可見發(fā)育較小的胚，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)萌發(fā);DAP180種子白色，伸長呈絮狀，顯微鏡下可見明顯胚體，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)萌發(fā);DAP270-480種子黃白色，粉狀，均在培養(yǎng)基上出現(xiàn)萌發(fā)，蒴果的寬度隨著生長時(shí)間的延長逐漸增加。DAP90、DAP180、DAP270種子萌發(fā)數(shù)量高于DAP60、DAP360、DAP480，說明建蘭種子成熟度對種子萌發(fā)有較大影響。

DAP/d蒴果 Capsule重量/g寬度/cm特征種子特征萌發(fā)數(shù)量601.150.91深綠色，飽滿白色，細(xì)小，緊貼于胎座組織/902.191.18深綠色，飽滿白色，細(xì)小，緊貼于胎座組織++1802.181.26深綠色，飽滿白色，絮狀++2701.731.36深綠色，飽滿黃白色，粉狀++3603.421.90深綠色，飽滿黃白色，粉狀+4803.361.96尖端褐色，干枯開裂黃白色，粉狀+注：因早期建蘭種子細(xì)小并粘黏在一起，不能精確統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量，所以無法得出具體的萌發(fā)率，用“/”代表無萌發(fā)，“+”代表萌發(fā)數(shù)量，“+”越多，萌發(fā)數(shù)量越多。

2.2液體、固體培養(yǎng)方式對建蘭種子萌發(fā)的影響

液體、固體培養(yǎng)方式對建蘭種子的萌發(fā)影響較大，液體培養(yǎng)方式種子的萌發(fā)率為39.56%，較固體培養(yǎng)萌發(fā)率23.47%更高。在液體培養(yǎng)基中種子充分接觸水與營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)稀釋了種子萌發(fā)抑制物，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[21]。因此在本試驗(yàn)中，液體培養(yǎng)基較固體培養(yǎng)基更能提高建蘭種子的萌發(fā)率。

2.3不同濃度6-BA與NAA對建蘭種子萌發(fā)的影響

不同濃度6-BA與NAA對建蘭種子萌發(fā)率影響均有顯著性差異。不添加任何外源植物生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，種子也可萌發(fā)，萌發(fā)率為16.43%。添加不同濃度6-BA與NAA后，可明顯提高種子的萌發(fā)率，隨著6-BA與NAA濃度的增加，萌發(fā)率和萌發(fā)生長指數(shù)逐漸增加，在濃度為2mg/L時(shí)，種子的萌發(fā)率可分別達(dá)到96.27%、95.84%，極顯著高于對照組，較對照組增加了486%、483%;種子的萌發(fā)指數(shù)可分別達(dá)到27.76、20.82，遠(yuǎn)高于對照組，較對照組增加了658%、469%，這說明2mg/L 6-BA與NAA都能顯著提高種子萌發(fā)率，且種子在2mg/L 6-BA中萌發(fā)后的生長速度更優(yōu)。因此，建蘭種子適宜萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS+2mg/L 6-BA+25g/L蔗糖（暗培養(yǎng)）。

3討論

成熟度是蘭科植物種子萌發(fā)的影響因素之一，許多蘭科植物種子完全成熟后種子的萌發(fā)率遠(yuǎn)低于未成熟種子。本實(shí)驗(yàn)研究表明，建蘭種子不同發(fā)育階段對其萌發(fā)有較大影響：DAP60種子過于細(xì)小、幼嫩，尚無萌發(fā);DAP360及以后的種子萌發(fā)率低于DAP90、DAP180、DAP270種子，這說明建蘭種子過于幼嫩或高度成熟均不利于種子萌發(fā)，此研究結(jié)果與大花杓蘭（C. macranthum）、小葉兜蘭（P. barbigerum）、C. reginae、黃花杓蘭 （C. flavum）結(jié)果相似。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性脫落酸濃度隨著種子成熟度的增加而增加，高濃度的脫落酸是阻礙種子萌發(fā)的主要因素，這可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因之一。Yamazaki and Miyoshi認(rèn)為，在種子成熟過程中木質(zhì)素等物質(zhì)在胚胎周圍的內(nèi)珠被積累，對誘導(dǎo)成熟種子休眠具有重要作用。也有人認(rèn)為，蘭科植物種子在成熟過程中內(nèi)種皮會變成一層“Carapace”的封閉結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致成熟種子的種皮滲透性差，種子萌發(fā)困難。因此，成熟種子內(nèi)的抑制萌發(fā)物質(zhì)，或種皮滲透性差，抑或是以上因素共同作用引起種子休眠，降低了成熟種子萌發(fā)率;過于幼嫩種子可能由于胚發(fā)育不完全，而未發(fā)生萌發(fā)。

雖然建蘭種子在液體培養(yǎng)基中萌發(fā)率更高的結(jié)果與Zeng S、丁長春關(guān)于兜蘭的研究結(jié)果一致，但液體培養(yǎng)方式不一定適合所有蘭科植物種子。這可能是因?yàn)橐后w培養(yǎng)存在缺少氧氣及長時(shí)間培養(yǎng)營養(yǎng)不足的問題。因此在液體培養(yǎng)的過程中可以減少液體培養(yǎng)的時(shí)間、定期加入營養(yǎng)液并及時(shí)將萌發(fā)的原球莖轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基中，從而促進(jìn)種子萌發(fā)及萌發(fā)后原球莖的健康生長。

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