蔡瑤 周雪珂 江朝源 曾喻兵 徐志文 朱玲

關(guān)鍵詞：豬;腸外致病性大腸桿菌;化膿隱秘桿菌;分離鑒定;混合感染;毒力基因

中圖分類號(hào)：S852.61+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0254-03

Key words：pig;extraintestinal pathogenic Escherichia coli;Trueperella pyogenes;isolation and identification;mixed infection;virulence gene

大腸桿菌是一種重要人畜共患病病原體，可感染人和多種動(dòng)物，根據(jù)其對(duì)宿主寄生部位不同，劃分為腸內(nèi)致病性大腸桿菌和腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）[1]。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了關(guān)于ExPEC的感染案例，指出其可特異性定殖于宿主腸道外，使感染宿主發(fā)生不同程度的腦膜炎、敗血癥、泌尿道及呼吸道感染[2]。目前在ExPEC中發(fā)現(xiàn)了多種毒力因子，包括與其致病性相關(guān)的毒力島（PAI）、黏附素、侵襲素、毒素、表面抗原、鐵攝取系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)等[3]。

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes，原名Arcanobacterium pyogenes）又名化膿放線菌或化膿棒狀桿菌，為隱秘桿菌屬（Trueperella）細(xì)菌。可以感染牛、羊、豬、林麝等重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也可以感染人，是一種機(jī)會(huì)致病菌[4]?；撾[秘桿菌可在家畜間廣泛傳播，常引起感染動(dòng)物化膿性肺炎及乳房炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性淋巴結(jié)炎，甚至?xí)斐伤拗髁鳟a(chǎn)和不孕等，最嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)膿毒敗血癥導(dǎo)致家畜死亡[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌毒力因子有 4 類，分別為化膿隱秘桿菌溶血素（PLO）、膠原結(jié)合蛋白質(zhì)（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白質(zhì)（Fim）[6]。

秋季早晚溫差大，豬群發(fā)生呼吸道疾病的可能性增加，發(fā)病的原因也是多種多樣，多數(shù)由細(xì)菌、病毒或寄生蟲等感染，甚至由多種病原混合感染誘發(fā)[7]。2018年10月，四川省蒲江地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)部分豬只出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，包括仔豬、保育豬、母豬均有發(fā)病，具體表現(xiàn)為呼吸急促且伴隨厚重的喘氣聲，耳部發(fā)紺，眼部、鼻腔部黏液增多，采食減少，體溫升高，最后因呼吸衰竭而亡。采用常用細(xì)菌分離方法結(jié)合16S rRNA基因序列分析綜合鑒定病原菌，分離出1株腸外致病性大腸桿菌和1株化膿隱秘桿菌。為詳細(xì)了解細(xì)菌毒力情況，對(duì)這2種菌進(jìn)行特異性毒力基因檢測(cè)，同時(shí)選用常用抗生素對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床用藥提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1樣品來(lái)源

樣品來(lái)源于四川省蒲江某豬場(chǎng)發(fā)病瀕死保育豬，無(wú)菌采集病豬心臟、肺臟、肝臟及肺門淋巴結(jié)、脾臟備用。

1.2細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

細(xì)菌基因組DNA的提取按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)菌16S rRNA通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，F(xiàn)-16S rRNA為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R-16S rRNA為5′- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 465 bp。反應(yīng)體系（30 μl）：上、下游引物各0.5 μl（20 μmol/L），細(xì)菌基因組1.5 μl（634 ng/μl），2×Taq PCR MasterMix 15.0 μl，ddH2O 12.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。

PCR產(chǎn)物用回收試劑盒回收片段，與pMD-19T載體16 ℃過(guò)夜連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后送至上海生物工程公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表菌株序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3分離株毒力因子的檢測(cè)及測(cè)序

根據(jù)文獻(xiàn)[8]～[10]所設(shè)計(jì)的9對(duì)腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）毒力基因papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT特異性引物，同時(shí)根據(jù)Zastempowska等[11]、徐凝等[12]設(shè)計(jì)的8對(duì)化膿隱秘桿菌的毒力基因plo、nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimE、fimG特異性引物檢測(cè)兩種細(xì)菌的毒力基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別以大腸桿菌和化膿隱秘桿菌基因組為模板進(jìn)行毒力因子的擴(kuò)增，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4藥敏試驗(yàn)

參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[13]，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定兩株菌對(duì)臨床上常用抗生素的敏感情況，測(cè)量抑菌圈的直徑，判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1分離株16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果及進(jìn)化樹分析

提取分離菌株DNA，用16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增出1 465 bp的目的片段，測(cè)序后將結(jié)果與GenBank上已發(fā)表序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示疑似大腸桿菌菌株（MS-1）與大腸桿菌CP022959.1同源性達(dá)99%且位于一個(gè)分支上，疑似化膿隱秘桿菌菌株（MS-2）與化膿隱秘桿菌CP007519.1同源性達(dá)99%且位于一個(gè)分支上。確認(rèn)分離到1株大腸桿菌和1株化膿隱秘桿菌，且由于大腸桿菌是從患病豬的肺部病變區(qū)域中分出，在病豬腸道并未發(fā)現(xiàn)明顯的病變，初步判定該大腸桿菌為腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）。

2.2分離菌株毒力因子擴(kuò)增結(jié)果

以大腸桿菌基因組為模板，對(duì)9種毒力因子進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出iutA（314 bp）、fyuA（787 bp）基因，未擴(kuò)增出papA、sfaS、focG、hlyD、afa、ireA、vaT基因;以化膿隱秘桿菌基因組為模板，對(duì)8種毒力因子進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出plo （150 bp）、nanH （1004 bp）、fimA （605bp）、fimC（843bp）、fimG（929bp）基因，未擴(kuò)增出nanP、cbpA、fimE基因。

2.3藥敏試驗(yàn)

分別對(duì)分離出的大腸桿菌和化膿隱秘桿菌進(jìn)行常用抗生素的敏感性試驗(yàn)，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)紙片法抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判斷，結(jié)果顯示兩種菌對(duì)慶大霉素、頭孢噻肟以及氟苯尼考均表現(xiàn)敏感。

3討論

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀以及實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)菌分離和16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果，結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果（未發(fā)現(xiàn)患病豬有寄生蟲感染跡象，且常見(jiàn)呼吸道病毒性疾病檢測(cè)結(jié)果全部為陰性），綜合判定該豬場(chǎng)疫情由大腸桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染造成。

有研究者認(rèn)為，從動(dòng)物腸道以外的臟器中分離到的大腸桿菌均可判定為ExPEC，也有人提出可根據(jù)大腸桿菌攜帶的特定毒力基因種類和數(shù)量初步確定是否為ExPEC[14]。在本研究中，我們從豬肺臟中分離出1株具有較強(qiáng)致病性的大腸桿菌，通過(guò)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌具有iutA、fyuA 2種毒力基因，綜合判定其為腸外致病性大腸桿菌。iutA是大腸桿菌代謝相關(guān)毒力基因，是鐵攝取蛋白系統(tǒng)中的一種基因，對(duì)細(xì)菌的生存至關(guān)重要。fyuA基因也參與鐵的攝取，是耶爾森強(qiáng)毒力島（HPI）中的核心結(jié)構(gòu)和功能基因，與大腸桿菌毒力的進(jìn)化密切相關(guān)[3]。Jost等[4]研究結(jié)果表明，化膿隱秘桿菌的毒力是由多種毒力因子決定的，各類毒力基因具有協(xié)同作用，并且細(xì)菌可以在不同宿主中差異表達(dá)各種毒力基因而引發(fā)不同的感染癥狀。本研究中分離出的化膿隱秘桿菌中檢測(cè)出8種毒力基因中的5種（plo、nanH、fimA、fimC、fimG），其中plo編碼的溶血素（plo）是一種細(xì)菌外毒素，能夠裂解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞，引起動(dòng)物皮膚壞死最終死亡。神經(jīng)氨酸酶nanH也具有多種毒力作用：分解宿主唾液酸作為碳源提高自身在宿主的生存力;降低細(xì)胞膜表面的黏滯性，促進(jìn)其對(duì)宿主細(xì)胞的感染力;分解免疫球蛋白IgA，降低宿主防御能力。針對(duì)化膿隱秘桿菌菌毛合成蛋白質(zhì)的研究還不夠深入，只知道其與細(xì)菌的黏附作用相關(guān)，目前已報(bào)道的4種化膿隱秘桿菌菌毛合成蛋白質(zhì)中，本研究分離的菌株中含3種，推測(cè)該菌可能具有較強(qiáng)的黏附性。

大腸桿菌是豬臨床中較為常見(jiàn)的一種傳染病原，以往也有腸外致病性大腸桿菌引發(fā)豬肺炎的病例報(bào)道[15]，而化膿隱秘桿菌感染的案例在林麝、牛、羊中報(bào)道的較多，對(duì)豬感染的案例相對(duì)較少。但近年來(lái)，國(guó)內(nèi)報(bào)道從豬呼吸道疾病中分離出化膿隱秘桿菌的頻率也逐年提高[16-19]。在林麝[20]、奶牛[21-22]中有報(bào)道大腸桿菌會(huì)同化膿隱秘桿菌混合感染，尤其是奶牛，在大多數(shù)患有乳房炎和子宮炎的奶牛中都能分離出大腸桿菌和化膿隱秘桿菌。但是，在豬呼吸道疾病中卻幾乎沒(méi)有大腸桿菌同化膿隱秘桿菌混合感染的病例報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)這2種細(xì)菌在豬中的混合感染，對(duì)今后豬病的研究具有較好的參考價(jià)值。Jost等[4]在對(duì)機(jī)會(huì)致病菌化膿隱秘桿菌的研究中也發(fā)現(xiàn)，化膿隱秘桿菌不是具有實(shí)質(zhì)致病潛力的細(xì)菌，往往同其他病原體共同感染導(dǎo)致宿主發(fā)病。Zerbe等[21]和Bicalho等[22]在大腸桿菌和化膿隱秘桿菌的毒力因子與奶牛子宮疾病的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染后會(huì)抑制奶牛子宮中性粒細(xì)胞的功能，很有可能是大腸桿菌先感染奶牛子宮造成子宮內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，從而給化膿隱秘桿菌提供適宜的生存條件，繼發(fā)感染導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎的加重和生殖功能衰竭。Wagener等[23]研究發(fā)現(xiàn)并不是所有大腸桿菌都會(huì)促進(jìn)化膿隱秘桿菌的感染，而只有腸外致病性大腸桿菌菌株（ExPEC）才能促進(jìn)化膿隱秘桿菌感染。對(duì)小鼠的致病性研究結(jié)果表明，兩種菌混合感染會(huì)相互加強(qiáng)毒力。而藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種菌對(duì)慶大霉素、頭孢噻肟以及氟苯尼考均表現(xiàn)敏感，這3種藥物對(duì)兩種病原菌均可能具有較強(qiáng)的殺滅作用。

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（責(zé)任編輯：張震林）