陳傳波，李 雙，朱振東，王學(xué)貴，殷麗琴，付紹紅，李 云，王繼勝，楊 進(jìn)*，鄒 瓊，陶蘭蓉，康澤明，唐 蓉

(1.成都大學(xué)，四川 成都 610000；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院, 成都 溫江 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 溫江 611130)

在我國(guó)油菜作為生產(chǎn)上重要的油料作物之一，除了供給60%左右的國(guó)產(chǎn)植物食用油外，還在化學(xué)工業(yè)等方面起著重要作用[1]。雖然目前我國(guó)油菜種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一，但面對(duì)日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求，提高油菜生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)是當(dāng)前急需得到重視的問題[2-4]。大巢菜、婆婆納、豬殃殃、棒頭草、稻槎菜、羊蹄與牛繁縷等我國(guó)冬油菜主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)雜草是影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一[5]，特別是羊蹄(RumexjaponicusHoutt.)作為一種蓼科酸模屬多年生草本植物[6]，其生長(zhǎng)常常伴隨油菜整個(gè)生長(zhǎng)期，對(duì)油菜的危害很大，不僅與油菜爭(zhēng)水、肥、光和生存空間，而且易作為病蟲害越冬越夏的場(chǎng)所，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。當(dāng)前利用化學(xué)除草劑是控制田間雜草的主要手段之一，但同時(shí)存在諸多不可避免的問題(如：長(zhǎng)期使用單一化學(xué)除草劑會(huì)使得雜草對(duì)化學(xué)除草劑敏感性下降、對(duì)闊葉雜草的除草劑缺乏及由于農(nóng)戶用藥不當(dāng)引起的藥害、農(nóng)藥殘留等[8])，此外，除草劑的類型、施用量、劑型、可防控的雜草種類、氣候及土壤條件都嚴(yán)重影響除草劑的有效性[9]。自2003年，德國(guó)拜耳公司[10]在合理混用不同類型的除草劑來擴(kuò)大殺草譜、提高藥效、減少用藥量、低殘留、提高安全性等方面取得一些進(jìn)展后，除草劑混劑的開發(fā)與應(yīng)用越發(fā)受到人們的重視[11]。2種或2種以上除草劑混用，對(duì)雜草的作用可能增加或降低藥效，混用結(jié)果出現(xiàn)3種效應(yīng)。即加成作用(混用后的藥效，表現(xiàn)該混劑的各藥劑單用之和)。一般講化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、作用機(jī)制相同的除草劑混用時(shí)，多表現(xiàn)為加成作用、增效作用(混用后對(duì)同一種植物的毒力之和增大時(shí)，其聯(lián)合作用應(yīng)屬于增效作用)和拮抗作用(混劑對(duì)同一種植物的毒力較各藥劑單用的毒力之和顯著降低時(shí)，其聯(lián)合作用應(yīng)屬于拮抗作用)。

丙酯草醚是一種新型田除草劑，它是一種2-嘧啶氧基芐基取代苯基胺類衍生物，主要被植物的根、芽、莖、葉吸收可雙向傳導(dǎo)，藥效發(fā)揮較快，持效期長(zhǎng)，能對(duì)禾本科雜草看麥娘、日本看麥娘等和闊葉雜草牛繁縷、繁縷等表現(xiàn)出較好的防治效果，且對(duì)目標(biāo)作物安全無(wú)藥害，是一種高效安全的油菜田除草劑[12]。前人研究表明，丙酯草醚屬于以ALS(乙酰乳酸合成酶)為作用點(diǎn)阻止Val、Ile、Leu的生物合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞有絲分裂的抑制劑[13]。另外，吡唑草胺是一種內(nèi)吸輸導(dǎo)性除草劑，具有廣泛的生物活性，它是通過阻礙蛋白質(zhì)合成而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的乙酰苯胺類除草劑，對(duì)作物田的播后苗前和苗后初期的一年生禾本科雜草如野燕麥、馬唐、狗尾草等一年生闊葉雜草羊蹄、莧、婆婆納等效果顯著[14]。前人對(duì)吡唑草胺原藥誘發(fā)V79和CHL細(xì)胞基因突變和染色體畸變的研究表明，吡唑草胺原藥無(wú)致基因突變作用，當(dāng)其濃度超出一定范圍時(shí)，才有致染色體結(jié)構(gòu)畸變作用，因此，吡唑類化合物以高效、低毒等特點(diǎn)而在農(nóng)藥中扮演著十分重要的角色[15]。

目前，關(guān)于丙酯草醚對(duì)田間主要雜草的防除效果雖有報(bào)道，但關(guān)于吡唑草胺對(duì)田間主要雜草的防除效果報(bào)道較少，特別是兩種除草劑混劑組合對(duì)油菜田間雜草的的防除效果更是鮮有報(bào)道。本研究采用盆栽法評(píng)價(jià)了不同復(fù)配比例的吡唑草胺與丙酯草醚對(duì)油菜田間闊葉雜草羊蹄的防治效果，并進(jìn)一步測(cè)定了兩種藥劑的理想復(fù)配比例對(duì)羊蹄和油菜常規(guī)的生理生化(鮮重、葉綠素含量及ALS活性)的影響，以期能為進(jìn)一步開發(fā)該出兩種除草劑的復(fù)配制劑來控制油菜田一年或多年生雜草提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試雜草 一年生闊葉雜草羊蹄(RumexjaponicusHoutt)雜草種子，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究實(shí)驗(yàn)室收集、保存并提供。

1.1.2 供試油菜 蓉油10(甘藍(lán)型油菜)，由成都市農(nóng)林科學(xué)院作物所油菜育種課題組提供。

1.1.3 供試藥劑 95%丙酯草醚原藥(山東僑昌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司)；95%吡唑草胺原藥(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司)。

1.1.4 試驗(yàn)試劑 丙酮、MgC12、95%乙醇、丙酮酸鈉、CaCO3、石英砂、NaOH、硫胺焦磷酸、TPP、黃素腺嘌呤二核苷酸FAD、肌酸、K2HPO4、甲萘酚、KH2PO4、H2SO4等(皆為AR試劑)。

酶促反應(yīng)緩沖液：內(nèi)含0.1mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.5)、20.0mmol/L丙酮酸鈉、1.0mmol/LMgC12、0.5mmol/LTPP和0.01mmol/LFAD。

提取緩沖液：內(nèi)含0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.5)、1.0mmol/L丙酮酸鈉、5.0mmol/L MgC12、0.5mmol/L TPP和0.01mmol/L FAD。

1.1.5 儀器設(shè)備 UV-2000紫外分光光度計(jì)、CP224S電子天平、DT200電子天平、TGL-16B離心機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 藥劑復(fù)配比例組合設(shè)計(jì) 根據(jù)除草劑篩選原則(Gowing法)[16]，按照丙酯草醚和吡唑草胺在油菜田的施用劑量，各單劑及復(fù)配比例分別設(shè)置5個(gè)梯度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，總計(jì)16個(gè)處理(表1)。

1.2.2 靶標(biāo)雜草的準(zhǔn)備 將采集和室內(nèi)保存的靶標(biāo)雜草種子破休眠后浸種催芽，待露白后選擇飽滿的種子，點(diǎn)播于裝有營(yíng)養(yǎng)土的育苗缽(直徑為0.10m×0.10m)內(nèi)，每盆播30粒，大棚溫室內(nèi)培養(yǎng)至羊蹄1葉1心期間苗，每缽保留4～5株雜草。待雜草5～6葉期時(shí)備用。

1.2.3 藥劑復(fù)配比例的篩選 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將5～6葉期的羊蹄進(jìn)行噴霧處理，每處理設(shè)置3次重復(fù)(每個(gè)重復(fù)5盆)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，施藥后保持土壤濕潤(rùn)。并與藥后10d對(duì)各處理靶標(biāo)雜草鮮重進(jìn)行稱量。

1.2.4 復(fù)配比例對(duì)羊蹄和油菜的生理生化 采用1.2.2方法進(jìn)行盆栽羊蹄和油菜，待其4～5葉期，采用丙酯草醚和吡唑草胺，以及增效比例對(duì)羊蹄和油菜進(jìn)行處理，測(cè)定藥后各處理葉綠素和ALS酶活性的影響。在施藥后1、4、7d，分別收集油菜和羊蹄地上部位葉片5g左右，同時(shí)設(shè)置3次樣本重復(fù)，葉綠素和ALS酶活性測(cè)定樣本分別采集，并做好標(biāo)記保存在封口袋中，存于4℃冰箱中備用。

表1 除草劑復(fù)配比例與濃度

1.2.5 葉綠素含量的測(cè)定 采用張蜀秋的方法[17]，略有改動(dòng)。用4mL95%的無(wú)水乙醇提取各個(gè)處理的葉片0.5g，放置離心機(jī)中于10000rpm下離心10min，取出其中的上清液部分；同樣加入相同體積的提取液與沉淀中再次離心，將2次所得上清液定容至25mL后用分光光度計(jì)測(cè)定其在663與646nm處的光吸收值，最終計(jì)算出葉綠素含量(mg/g)。

1.2.6 ALS活性的測(cè)定 提取ALS：對(duì)盆栽試驗(yàn)中的5～6葉期羊蹄與油菜幼苗地上綠葉部分，進(jìn)行稱量并剪碎后用液氮研磨成粉末狀。再用適量石英砂加入其中，提取緩沖液按1∶1(g/mL)的比例加入，進(jìn)行充分的研磨后倒入離心管放置在離心機(jī)里進(jìn)行離心，濾液離心(20000g 20min)，取出上清液作為粗酶液放置4℃以下保存待用。提取過程應(yīng)在0～4℃的低溫冰浴條件下進(jìn)行[18]。

ALS活性的測(cè)定：將1mL酶促反應(yīng)液和0.5mL粗酶液加入于試管中，先于對(duì)照組中加入3moL/L H2SO40.2mL來終止反應(yīng)而測(cè)定組不加，然后在37℃水浴箱中水浴1h后加入3moL/L H2SO4，0.2mL對(duì)測(cè)定組的反應(yīng)進(jìn)行終止。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在60℃脫羧15min，再順次加入0.5%肌酸(溶于去離子水)0.5mL和5%甲萘酚(溶于2.5moL/L NaOH)0.5mL，放置在60℃反應(yīng)15min。然后取出進(jìn)行反復(fù)搖勻使其顯色，讓顯色反應(yīng)液置于室溫下降至室溫后，將其置于分光光度計(jì)在530nm處比色[19]。蛋白含量根據(jù)Bradford(1976)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[20]。酶活力用單位時(shí)間內(nèi)每毫克蛋白催化反應(yīng)的吸光值表示(0D530/mg protein/h)。

1.3 試驗(yàn)結(jié)果處理

1.3.1 藥劑復(fù)配配比篩選結(jié)果處理 除草劑混用藥效測(cè)定及評(píng)價(jià)方法，采用Gowing法。

其中：X為A單劑防效(%)；Y為B單劑防效(%)；E0為A、B兩單劑相混的理論防效(%)；E為A、B兩單劑相混的實(shí)際防效(%)；E-E0>10%為增效作用；E-E0<-10%為拮抗作用；E-E0值介于理論值±10%為加成作用。

1.3.2 復(fù)配配比生理生化的結(jié)果處理 參照張敏等的方法[21]，計(jì)算出單劑各濃度處理組對(duì)雜草各指標(biāo)的抑制率及混劑各濃度處理組實(shí)際抑制率與理論抑制率的百分比M。

計(jì)算公式為：M=混劑處理組實(shí)際抑制率/(單劑1抑制率×在混劑中所占比例+單劑2抑制率×在混劑中所占比例)。

其中：M在100左右(一般小于120)為相加作用；明顯高于100(大于120)為增效作用；明顯小于100(一般為80以下)為拮抗作用。

通過計(jì)算得出各處理的葉綠素含量、ALS活性，并運(yùn)用SPSS Statistics17.0進(jìn)行Duncan(0.05)方差分析并比較與通過用Sigmaplot 10.0作圖來進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)復(fù)配比例的篩選

2.1.1 各處理對(duì)羊蹄鮮重影響 結(jié)果表明(表2)，丙酯草醚與吡唑草胺五個(gè)不同復(fù)配比例的混劑對(duì)羊蹄的E-E0值分別為-8.61%，-8.98%，-9.91%，-4.63%，-0.49%，這5個(gè)復(fù)配比例均處于±10%之間，表現(xiàn)出加成作用。綜合考慮生產(chǎn)成本和兩種藥劑聯(lián)合作用除草效果等情況，選用60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺的配方來測(cè)取藥劑對(duì)羊蹄和油菜的生理生化影響。

2.2 丙酯草醚與吡唑草胺復(fù)配比例對(duì)羊蹄和油菜的生理生化

2.2.1 復(fù)配比例對(duì)羊蹄與油菜葉綠素含量的影響 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺與60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例處理羊蹄結(jié)果表明(圖1A)：在三類藥劑處理后1d、4d、7d，羊蹄葉綠素含量均顯著低于空白對(duì)照處理(P<0.05)，且三類藥劑對(duì)羊蹄的葉綠素含量在藥后1d到4d差異不顯著，但在7d時(shí)該復(fù)配藥劑對(duì)羊蹄葉綠素含量的抑制明顯高于兩單劑處理。隨著時(shí)間的增加，三類藥劑處理對(duì)羊蹄葉綠素的抑制率逐漸增加(14.0～27.1、15.4～31.7和21.4～40.0)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL復(fù)配藥劑對(duì)羊蹄葉綠素的增效率M在藥后1d、4d、7d則分別達(dá)到142.4、147.5和152.8，表現(xiàn)出增效作用(圖1B)。

表2 藥后10d丙酯草醚與吡唑草胺對(duì)羊蹄鮮重影響

油菜葉綠素含量結(jié)果表明(圖1C)：三類藥劑處理后1d與空白對(duì)照差異均不顯著(P>0.05)，而在藥后4d和7d，油菜葉綠素含量均顯著低于空白對(duì)照(P<0.05)，但三類藥劑處理之間差異不顯著；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，三類藥劑處理對(duì)油菜葉綠素的抑制率緩慢上升(6.0～19.1、6.8～21.0和9.6～23.6)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL復(fù)配藥劑對(duì)油菜葉綠素的增效率M在藥后1d、4d、7d呈下降趨勢(shì)，分別達(dá)到154.5、122.8和120.8，表現(xiàn)出增效作用(圖1D)。

2.2.2 復(fù)配比例對(duì)羊蹄與油菜ALS活性的影響 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺與60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配藥劑對(duì)羊蹄ALS活性的結(jié)果表明(圖2A)：在三類藥劑處理1d后，ALS的活性均顯著低于空白對(duì)照(P<0.05)，且三類藥劑對(duì)羊蹄ALS活性差異不顯著；三類藥劑處理4d和7d時(shí)，60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例對(duì)羊蹄ALS活性明顯低于兩單劑處理。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，三類藥劑處理對(duì)羊蹄ALS活性的抑制率逐漸增加(17.2～31.4、20.0～32.6和26.2～44.3)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例的增效率M在藥后1d、4d和7d分別達(dá)到146.8、138.9和139.9，表現(xiàn)出增效作用(圖2B)。

增效比例對(duì)油菜ALS活性的結(jié)果(圖2C)顯示，藥后1d，三類藥劑處理與空白對(duì)照差異均不顯著(P>0.05)；藥后4d和7d，三類藥劑處理油菜ALS活性顯著低于空白對(duì)照(P<0.05)；在藥后1d與7d，丙酯草醚60μg/mL和吡唑草胺200μg/mL與復(fù)配藥劑對(duì)油菜ALS活性差異不顯著，但在4d時(shí)復(fù)配藥劑對(duì)油菜ALS活性明顯低于兩單劑；且三類藥劑處理對(duì)油菜ALS活性的抑制率隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加強(qiáng)(5.8～14.6、7.1～14.6和11.5～17.7)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配藥劑對(duì)油菜葉綠素的增效率M在藥后1d、4d和7d呈下降趨勢(shì)，分別為189.7、137.8和120.9，表現(xiàn)出增效作用(圖2D)。

3 討論與結(jié)論

合理使用除草劑可以有效防除農(nóng)田雜草的發(fā)生，但前提是對(duì)作物安全。本文研究結(jié)果表明，在單一使用丙酯草醚時(shí)，羊蹄鮮重隨藥劑濃度增加而增加；在單一使用吡唑草胺時(shí)，羊蹄鮮重隨藥劑濃度減小反而增加；而所有復(fù)配比例對(duì)羊蹄鮮重防效均表現(xiàn)出相加作用，且明顯高于單一藥劑對(duì)羊蹄鮮重防效?？紤]到成本、防治效果及安全性等因素，本研究選用吡200+丙60的復(fù)配比例配方來測(cè)取藥劑對(duì)羊蹄與油菜的生理生化影響，結(jié)果表明篩選得到復(fù)配藥劑的對(duì)羊蹄的葉綠素含量與ALS活性有著較好的抑制作用，而對(duì)油菜幼苗的葉綠素含量與ALS活性抑制效果較小，表現(xiàn)出較好的選擇性。本試驗(yàn)復(fù)配比例在藥后7d結(jié)果顯示，復(fù)配比例處理對(duì)羊蹄葉綠素含量的抑制率達(dá)到了40.0%，而對(duì)油菜的僅有23.6%，丙酯草醚對(duì)油菜幼苗的葉綠素含量也有一定的抑制作用。郭翔等[22]研究發(fā)現(xiàn)，500、1000mg/L濃度丙酯草醚處理下大麥葉片的非光化學(xué)淬滅(NPQ)值表現(xiàn)出先升高后下降的現(xiàn)象，說明了植株能上調(diào)NPQ來保護(hù)光合系統(tǒng)，降低外界影響對(duì)光合系統(tǒng)的傷害。本研究亦發(fā)現(xiàn)，施藥后1d、4d和7d時(shí)，復(fù)配比例對(duì)羊蹄的葉綠素含量抑制率的增效率在隨著時(shí)間的增加而增加，而對(duì)油菜的增效率卻是隨之減少，分析可能為除草劑施用后，油菜在藥劑脅迫壓力下，迅速誘導(dǎo)激發(fā)作物應(yīng)對(duì)保護(hù)機(jī)制，隨著時(shí)間的驗(yàn)證，這種保護(hù)作用越發(fā)增強(qiáng)，從而降低藥劑的影響，這與郭翔等研究相符。

此外，除草劑植物體內(nèi)吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)的難易能影響藥效的發(fā)揮，所以除草劑在作物與雜草之間的吸收和傳導(dǎo)的差異是選擇性作用的原因之一[23]。趙丹丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，丙酯草醚對(duì)牛繁縷ALS活性有著較大的抑制作用，且會(huì)隨著時(shí)間而增強(qiáng)，在第5d達(dá)到了53.6%，而對(duì)油菜卻沒有明顯的抑制作用。陳杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，丙酯草醚在45g ai/hm2條件下處理反枝莧，處理后測(cè)得ALS的活性明顯呈規(guī)律性下降，在第4d已經(jīng)下降了50%左右，有明顯的抑制作用，但除草活性發(fā)揮緩慢。本實(shí)驗(yàn)表明，羊蹄與油菜經(jīng)過丙酯草醚60μg/mL+吡唑草胺200μg/mL處理過后，對(duì)羊蹄的ALS活性有著明顯的抑制作用，并隨著時(shí)間的推進(jìn)而加強(qiáng)，在第7d達(dá)到了44.32%，而對(duì)油菜的ALS活性的影響卻不大，僅有17.71%；對(duì)羊蹄ALS的增效率隨時(shí)間增加先減后升，可能為丙酯草醚吸收輸導(dǎo)作用的差異導(dǎo)致前期增效較小，到后面吸收累積后作用效果明顯增加。另外，李政等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，水稻對(duì)丙酯草醚的吸收量要大于油菜，且隨時(shí)間推進(jìn)有增加的趨勢(shì)，丙酯草醚吸收量以及單位質(zhì)量中積累量在水稻與油菜中的差異可能是丙酯草醚對(duì)兩者產(chǎn)生選擇性的機(jī)理之一。推測(cè)在本研究中油菜和雜草羊蹄對(duì)丙酯草醚吸收量以及單位質(zhì)量亦存在類似的積累量差異，導(dǎo)致丙酯草醚對(duì)羊蹄的抑制明顯高于油菜，但這種機(jī)理目前尚不明，有待進(jìn)一步研究。

總之，除草劑對(duì)靶標(biāo)雜草產(chǎn)生的效果會(huì)受到產(chǎn)品質(zhì)量、環(huán)境、抗性、施用方式等諸多因素影響，本實(shí)驗(yàn)僅在盆栽實(shí)驗(yàn)對(duì)丙酯草醚與吡唑草胺的增效比例及生理生化進(jìn)行初步的探究，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其防治效果和安全性。