李鳴宇, 周 嬌, 王海香, 趙莉藺,*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山西太谷 030801;2. 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所, 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101)

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus屬于側(cè)尾腺綱(Secernentea)滑刃目(Aphelenchida)滑刃科(Aphelenchoididae)傘滑刃屬Bursaphelenchus(Nickleetal., 1981)，是一種林業(yè)重大外來入侵害蟲，造成的松材線蟲病，即松樹的“癌癥”，具有傳染快致死快，防治困難，一經(jīng)感染便無法治愈等特點(diǎn)(Mamiya, 1972, 1983; 寧眺等, 2005)。松材線蟲原產(chǎn)于北美洲，于20世紀(jì)初傳入亞洲，近些年來又?jǐn)U散到了歐洲國家，除北美洲原發(fā)地以外，對許多國家的森林生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的破壞。松材線蟲于1982年首次在我國南京中山陵發(fā)現(xiàn)，而后不斷擴(kuò)散，快速蔓延至江蘇、浙江、安徽、廣州和山東等53個(gè)縣市區(qū)，累計(jì)死亡松樹3 500萬株，近年來疫情逐步加劇，向中國北部蔓延(Yanoetal., 1913; 孫永春, 1982; Futai, 2008; Nakamura-Matorietal., 2008; Shin, 2008; Karnkowski and Sahajdak， 2010)。目前，松材線蟲已成為我國第一大林業(yè)害蟲，也是我國最為嚴(yán)重的林業(yè)外來有害生物，給病害發(fā)生區(qū)帶來了嚴(yán)重的損失(張星耀和駱有慶, 2003)。隨著國際貿(mào)易的全球化及我國加入世貿(mào)組織，松材線蟲由其他疫區(qū)傳入我國非疫區(qū)的可能性不斷加大，風(fēng)險(xiǎn)不斷加劇，而且由于國內(nèi)各種基建項(xiàng)目的施行及國內(nèi)經(jīng)濟(jì)貿(mào)易活動(dòng)的活躍，松材線蟲由我國國內(nèi)疫區(qū)傳入非疫區(qū)的可能性也在逐漸加大。因此，松材線蟲在我國仍具有十分廣泛的定殖及擴(kuò)散的可能(謝丙炎等, 2009; 魏亞楠, 2015)。

在中國和日本，松材線蟲的感染周期與松墨天牛Monchamusalternatus的羽化過程同步，并且沒有松墨天牛的攜帶，松材線蟲便無法被傳播。松材線蟲與松墨天牛間存在特殊的共生生活史。松材線蟲生活史包含繁殖和擴(kuò)散兩個(gè)周期，繁殖周期主要擴(kuò)大種群密度，致死松樹；擴(kuò)散周期則主要通過媒介昆蟲轉(zhuǎn)移至新寄主。當(dāng)松木內(nèi)松材線蟲大量繁殖，其對松樹的危害加劇，造成樹勢衰弱甚至枯死，從而吸引松墨天牛前來產(chǎn)卵。秋末冬初，此時(shí)樹勢已不利于繁殖型松材線蟲生長，繁殖型2齡幼蟲向擴(kuò)散型3齡幼蟲(LⅢ)轉(zhuǎn)變。此時(shí)，松墨天牛孵化、幼蟲蛻皮；翌年早春，樹體內(nèi)松墨天牛進(jìn)入蛹期，松材線蟲擴(kuò)散型3齡幼蟲(LⅢ)向松墨天牛蛹室聚集，松樹蒸騰作用降低、針葉萎蔫黃化。松材線蟲擴(kuò)散型3齡幼蟲(LⅢ)向擴(kuò)散型4齡幼蟲(LⅣ)的轉(zhuǎn)變與松墨天牛蛹的發(fā)育期相一致，翌年春天，待松墨天牛從死樹中羽化，可耐干旱及惡劣環(huán)境，也適合通過媒介昆蟲傳播的松材線蟲擴(kuò)散型4齡幼蟲(LⅣ)同步形成，并通過松墨天牛氣管轉(zhuǎn)移至新的健康松樹，每頭松墨天牛平均攜帶量約18 000條，最多可達(dá)289 000條(Mamiya, 1983)。

松材線蟲與松墨天牛的生活史顯示，兩者間特殊的共生關(guān)系構(gòu)成了松材線蟲病形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。松材線蟲擴(kuò)散型4齡幼蟲(LⅣ)通過其關(guān)鍵媒介松墨天牛的氣管被攜帶傳播，而松墨天牛與松材線蟲轉(zhuǎn)型擴(kuò)散發(fā)育進(jìn)程的一致性是松材線蟲擴(kuò)散表型增強(qiáng)的關(guān)鍵。松墨天牛在羽化過程中釋放大量C15-C18脂肪酸乙酯，啟動(dòng)松材線蟲Insulin和DA/DAF-12信號通路，改變發(fā)育途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)擴(kuò)散型3齡幼蟲(LⅢ)形成擴(kuò)散型4齡幼蟲(LⅣ)(Zhaoetal., 2013)。由LⅢ分泌的蛔甙能夠誘導(dǎo)松墨天牛中的蛻皮激素生成并上調(diào)蛻皮激素相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)松墨天牛蛹化。一旦天牛進(jìn)入成蟲階段，天牛分泌蛔甙并吸引LⅣ，從而促進(jìn)松材線蟲進(jìn)入松墨天牛氣管并被轉(zhuǎn)運(yùn)至新松樹上 (Zhaoetal., 2016)。

總之，深入研究松墨天牛與松材線蟲“協(xié)同互作”關(guān)系，對解釋松材線蟲擴(kuò)散型4齡幼蟲(LⅣ)被松墨天牛攜帶機(jī)制具有重要意義，對控制松墨天牛攜帶松材線蟲的傳播具有積極的理論和實(shí)際意義。因此，我們利用高通量Illumina HiSeqTM2000測序技術(shù)、通過組裝、功能注釋和分析，全面探討松墨天牛攜帶松材線蟲后各個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組信息，挖掘松墨天牛應(yīng)對松材線蟲的壓力響應(yīng)基因，從分子水平上提供松墨天牛攜帶松材線蟲后維持穩(wěn)態(tài)的基因信息，也為深入研究松墨天牛能夠攜帶松材線蟲的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

攜帶松材線蟲的松墨天牛采集自浙江富陽(30°07′N, 119°95′E)死亡的松樹上，對照組所用的未攜帶任何線蟲的松墨天牛收集自實(shí)驗(yàn)室種群。實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件：幼蟲放在裝有木屑飼料的10 cm的指型管中，每7 d換一次飼料；成蟲置于塑料盒中，每7 d換一次新鮮松枝，以上培養(yǎng)過程均置于人工氣候箱中，飼養(yǎng)溫度為20～25℃，相對濕度60%～70%，光周期12L∶12D。所有天牛在實(shí)驗(yàn)前均解剖出氣管并檢測攜帶線蟲情況及數(shù)量后，再收集組織用于文庫構(gòu)建。所選攜帶松材線蟲的松墨天牛樣本，體內(nèi)攜帶松材線蟲的數(shù)量為1 000～3 000頭。

1.2 文庫構(gòu)建

收集未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲表皮(EP-CK)、氣管(Tr-CK)、脂肪體(Fb-CK)以及攜帶松材線蟲的松墨天牛表皮(EP-Bx)、脂肪體(Fb-Bx)和氣管(Tr-Bx)，用PBS洗滌，隨后使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)從組織中分離總RNA，并在使用前儲存在-80℃冰箱。共構(gòu)建6個(gè)基因文庫，每個(gè)文庫構(gòu)建使用5頭天牛的組織合并為一個(gè)樣品。剩余的天牛尸體浸入PBS中統(tǒng)計(jì)線蟲的數(shù)量。用ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, 美國)測定RNA樣品濃度和純度。用Dynabeads mRNA純化試劑盒(Ambion; Thermo Fisher Scientific, 美國)純化mRNA。RNA-Seq文庫制備試劑盒(Compatible with Illumina, San Diego, CA, 美國，Illumina Whole-Genome Gene Expression BeadChip)用于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建，使用寡核苷酸(dT)磁珠(Thermo Fisher Scientific, 美國)富集含Poly A的mRNA，然后對其進(jìn)行片段化，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用MiniElute凝膠提取純化試劑盒320-420 bp產(chǎn)物(Qiagen, Hilden, 德國)，測序是在中國科學(xué)院基因組研究所的Illumina HiSeq 2000測序平臺上完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組拼接及注釋

在組裝之前，去除低質(zhì)量的原始reads，過濾去除微生物(細(xì)菌/病毒/真菌)和線蟲污染，獲得的clean reads用于后續(xù)拼接。短reads在Trinity(v.2013)中進(jìn)行Denovo組裝 (Grabherretal., 2011)。組裝的序列進(jìn)一步通過CD-HIT軟件(Li and Godzik, 2006) 進(jìn)行聚類，以精簡冗余序列并人工校對。為了使轉(zhuǎn)錄本盡可能全面并避免增加組裝的復(fù)雜性，將6個(gè)庫合并組裝，使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件(Li and Durbin, 2009)將測序讀數(shù)重新整合到unigenes上，評估組裝序列的準(zhǔn)確性。

使用BlastX軟件，將拼接轉(zhuǎn)錄本與NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(NR)和Swiss-Prot數(shù)據(jù)做比對，設(shè)置E-value<10-5為閾值，以第一匹配序列的信息作為注釋結(jié)果。使用Trinity軟件中的RSEM評估基因豐度水平，同時(shí)使用具有P<0.001的DEG-Seq 軟件鑒定差異表達(dá)的基因(DEG)，并使用以下規(guī)則標(biāo)記。將FDR(false discovery rate)作為篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，將|log2Ratio|≥2且Q-value≤0.05的基因作為差異表達(dá)基因，計(jì)算出上調(diào)與下調(diào)的基因數(shù)量。用KEGG(http:∥www.kegg.jp)和GO(http:∥wego.genomics.org.cn/)數(shù)據(jù)庫(Ogataetal., 1999)進(jìn)行功能富集分析。使用R軟件Pheatmap包(http:∥www.r-project.org/; R Foundation for Statistical Computing, Wien, 澳大利亞)繪制熱圖。本研究測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)SRA數(shù)據(jù)庫，BioProject PRJNA374773。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測1.3節(jié)篩選的在攜帶與未攜帶松材線蟲的松墨天牛間差異表達(dá)的基因在松墨天牛不同組織中的相對表達(dá)量。這些基因包括氣管中表達(dá)上調(diào)的核酸內(nèi)切酶V(endonuclease V)基因(ENV)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1)基因(CDK1)、熱激蛋白70-C(heat shock protein 70-C)基因(HSP70-C)、熱激蛋白70(heat shock protein 70)基因(HSP70)、雙重氧化酶(dual oxidase)基因(DUO)、多腺苷酸結(jié)合蛋白(PABPN1 protein)基因(PABPN1)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定亞基(insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit)基因(IGFP)、熱激蛋白75(heat shock protein 75)基因(HSP75)等。使用Primer Premier 6設(shè)計(jì)內(nèi)參基因Actin引物序列和目的基因引物序列，以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，引物信息詳見表1。所需引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系: 2×Talent qPCR Premix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA 2 μL, 超純水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)在ABI 7300Plus熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40次循環(huán)；接著進(jìn)行溶解曲線分析。表達(dá)結(jié)果依據(jù)Ct值, 采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。使用SPSS19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)控與評估

未攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管、表皮及脂肪體的Illumina測序共得到60 734 045條raw reads，去除不可用數(shù)據(jù)509 836條，最后得到60 224 209條clean reads。攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管、表皮及脂肪體的Illumina測序共得到66 296 151條raw reads，去除不可用數(shù)據(jù)715 587條，最后得到65 580 564條clean reads(表2)。上述結(jié)果說明可用reads在99%以上，本研究測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)，可用于進(jìn)一步分析。

對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類和組裝分析共得到55 059條unigenes，最大長度2 845 bp，最小長度為300 bp，平均長度為1 536 bp，中位數(shù)長度為906 bp，N50長度為2 516 bp。超過1 kb的unigenes有12 394條，占22.5%，超過2 kb的unigenes有13 219條，占24.0%。這些數(shù)據(jù)說明組裝效果理想。

表1 引物信息Table 1 Primer information

表2 松墨天牛成蟲各組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評估Table 2 Analysis of the transcriptome data of adult tissues of Monochamus alternatus

2.2 攜帶和未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲組織轉(zhuǎn)錄組中的差異表達(dá)基因

以未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲各組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為對照，攜帶松材線蟲天牛成蟲的氣管中有差異表達(dá)基因7 089個(gè)，其中上調(diào)基因4 526個(gè)，下調(diào)基因2 563個(gè)。表皮中有差異表達(dá)基因3 923個(gè)，其中上調(diào)基因2 575個(gè)，下調(diào)基因1 348個(gè)。脂肪體中有差異表達(dá)基因5 485個(gè)，其中上調(diào)基因1 748個(gè)，下調(diào)基因3 737個(gè)。氣管與表皮中共有的差異表達(dá)基因1 871個(gè)；其中二者全部上調(diào)的基因849個(gè)，全部下調(diào)的基因425個(gè)；氣管中上調(diào)而表皮中下調(diào)的基因265個(gè)，氣管中下調(diào)而表皮中上調(diào)的基因332個(gè)。表皮和脂肪體中共有的差異表達(dá)基因1 587個(gè)；其中二者全部上調(diào)的基因480個(gè)，全部下調(diào)的基因676個(gè)；表皮中上調(diào)而脂肪體中下調(diào)的基因214個(gè)，表皮中下調(diào)而脂肪體中上調(diào)的基因217個(gè)。氣管與脂肪體中共有的差異表達(dá)基因1 683個(gè)；其中二者全部上調(diào)的基因374個(gè)，全部下調(diào)的基因545個(gè)；氣管中上調(diào)而脂肪體中下調(diào)的基因481個(gè)，氣管中下調(diào)而脂肪體中上調(diào)的基因283個(gè)。氣管、表皮與脂肪體中共有的差異表達(dá)基因1 446個(gè)；三者全部上調(diào)的基因?yàn)?88個(gè)，全部下調(diào)的基因?yàn)?67個(gè)；氣管與表皮中上調(diào)而脂肪體中下調(diào)的基因?yàn)?03個(gè)，氣管與脂肪體中上調(diào)表達(dá)而表皮中下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?8個(gè)；表皮與脂肪體中上調(diào)而氣管中下調(diào)的基因?yàn)?9個(gè)；氣管中上調(diào)而表皮和脂肪體中下調(diào)的基因?yàn)?63個(gè)，表皮中上調(diào)而氣管與脂肪體中下調(diào)的基因?yàn)?8個(gè)；脂肪體中上調(diào)而氣管與表皮中下調(diào)的基因?yàn)?00個(gè)(圖1)。以上結(jié)果說明，松墨天牛氣管相對于表皮及脂肪體是主要響應(yīng)松材線蟲的組織。

2.3 差異表達(dá)基因的功能注釋

圖1 攜帶和未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of differentially expressed genes in Monochamus alternatus adults carrying and without carrying Bursaphelenchus xylophilusTr: 氣管Trachea; Ep: 表皮Epidermis; Fb: 脂肪體Fat body. 向上和向下的箭頭分別表示上調(diào)和下調(diào)基因。Up and down arrows indicate up-regulated and down-regulated genes, respectively.

利用BLASTX程序?qū)?5 059條unigenes序列與NR(14 234條unigenes), GO(4 022條unigenes)和KEGG(6 098條unigenes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，成功注釋到24 354條unigenes，占44.23%。

KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到6 098條基因，占11.1%。屬于氣管與表皮中的共有2 696條基因；經(jīng)過比對，相較于未攜帶松材線蟲的松墨天牛，攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管中上調(diào)表達(dá)基因與下調(diào)表達(dá)基因最多的均為復(fù)制和修復(fù)(replication and repair)相關(guān)的，分別為114和152條；表皮組織中上調(diào)表達(dá)基因最多的為折疊、分類和降解(folding, sorting and degradation)相關(guān)的，為54條，下調(diào)表達(dá)基因最多的為信號分子與相互作用(signaling molecules and interaction)相關(guān)的，為44條(圖2)。

GO數(shù)據(jù)庫注釋到4 022條基因，占7.3%；相較于未攜帶松材線蟲的松墨天牛，攜帶松材線蟲的松墨天牛表皮與氣管中上調(diào)的基因(圖3)中屬于細(xì)胞組分(cellular component)分類的主要有細(xì)胞(cell)、細(xì)胞外區(qū)域組分(cell part)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組分(intracellular part)等；屬于分子功能(molecular function)分類的主要為催化活性(catalytic activity)、水解酶活性(hydrolase activity)和轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)等；屬于生物學(xué)過程(biological process)分類的有代謝過程(metabolic process)、含氮化合物代謝過程(nitrogen compound metabolic process)和有機(jī)物代謝過程(organic substance metabolic process)等。下調(diào)的基因(圖4)中屬于細(xì)胞組分分類的主要有細(xì)胞(cell)、細(xì)胞外區(qū)域組分(cell part)和細(xì)胞內(nèi)液(intracellular fluid)等；屬于分子功能分類的主要為催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)和雜環(huán)基因的結(jié)合(heterocyclic compound binding)等；屬于生物學(xué)過程分類的有代謝過程(metabolic process)、含氮化合物代謝過程(nitrogen compound metabolic process)和有機(jī)物代謝過程(organic substance metabolic process)等。

圖3 在攜帶松材線蟲松墨天牛成蟲表皮與氣管轉(zhuǎn)錄組中上調(diào)基因的GO注釋分布Fig. 3 GO annotation distribution of up-regulated genes in epidermis and trachea transcriptomes of Monochamus alternatus adults carrying Bursaphelenchus xylophilusTr-u: 氣管中上調(diào)表達(dá)的基因Up-regulated genes in trachea; Ep-u: 表皮中上調(diào)表達(dá)的基因Up-regulated genes in epidermis.

圖4 在攜帶松材線蟲松墨天牛成蟲表皮與氣管轉(zhuǎn)錄組中下調(diào)基因的GO注釋分布Fig. 4 GO annotation distribution of down-regulated genes in epidermis and trachea transcriptomes of Monochamus alternatus adults carrying Bursaphelenchus xylophilusTr-d: 氣管中下調(diào)表達(dá)的基因Down-regulated genes in trachea; Ep-d: 表皮中下調(diào)表達(dá)的基因Down-regulated genes in epidermis.

其中，GO功能富集分析結(jié)果表明，氣管樣品中上調(diào)的基因主要富集在分子功能中的催化活性、結(jié)合、生物學(xué)過程中的代謝過程和細(xì)胞過程(圖3)；下調(diào)的基因則主要富集在細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞外區(qū)域組分、細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組分以及分子功能分類中的結(jié)合雜環(huán)基因的結(jié)合、環(huán)類有機(jī)物的結(jié)合和離子作用(圖4)。表皮樣品中上調(diào)的基因同樣主要富集在分子功能中的催化活性、結(jié)合以及生物學(xué)過程中的代謝過程、有機(jī)物代謝過程及初級代謝過程(圖4)；下調(diào)的基因則富集在分子功能中的催化活性、結(jié)合以及生物過程中的代謝過程、含氮化合物代謝過程和有機(jī)物代謝過程(圖4)。

2.4 松墨天牛脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的鑒定

通過GO, KEGG和NR注釋分析顯示，松墨天牛攜帶松材線蟲后，復(fù)制和修復(fù)相關(guān)功能通路基因表達(dá)顯著上調(diào)，熱圖分析進(jìn)一步表明其在攜帶松材線蟲的松墨天牛的表皮和氣管中顯著上調(diào)(圖5)。其中，氣管中上調(diào)表達(dá)的共濟(jì)失調(diào)蛋白(ataxin-3-like)基因、鋅指蛋白(zinc finger protein)基因、小核糖核蛋白顆粒蛋白SmE(small ribonucleoprotein particle protein SmE)基因，IGFP基因、ENV基因、CDK1基因、HSP70-C基因、HSP70基因、DUO基因、中鏈酰基輔酶A脫氫酶(medium-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondri)基因、錨蛋白重復(fù)和FYVE域蛋白(ankyrin repeat and FYVE domain-containing protein 1)基因、CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein)基因、參與囊泡運(yùn)輸?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)蛋白 (vesicle-associated membrane protein-associated protein B)基因，HSP75基因，可能的RNA解旋酶(putative RNA helicase mov-10-B.1)基因和半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin-C)基因等，與脅迫響應(yīng)相關(guān)(表3)。經(jīng)過定量PCR驗(yàn)證，其中CDK1基因、HSP70基因、HSP75基因、DUO基因、PABPN1基因和IGFP基因的表達(dá)量在攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲氣管中相比未攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管中的顯著上調(diào)(圖6)。

圖5 脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在攜帶與未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲組織中的表達(dá)熱圖Fig. 5 Heat map showing expression of genes related to stress response in the adult tissues of Monochamus alternatus carrying and without carrying Bursaphelenchus xylophilus

表3 攜帶和未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲各組織中顯著上調(diào)的壓力調(diào)節(jié)相關(guān)基因Table 3 Significantly up-regulated genes related to pressure regulation in adult tissues of Monochamus alternatus carrying and without carrying Bursaphelenchus xylophilus

續(xù)表3 Table 3 continued

圖6 脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在攜帶與未攜帶松材線蟲的松墨天牛成蟲氣管中表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證Fig. 6 Expression verification of stress response-related genes in trachea of Monochamus alternatus adults carrying and without carrying Bursaphelenchus xylophilus by real-time quantitative PCRA: ENV; B: CDK1; C: HSP70-C; D: HSP70; E: DUO; F: PABPN1; G: IGFP; H: HSP75. 基因表達(dá)量以Tr-CK(對照)中的為基準(zhǔn)，柱上星號和雙星號分別表示兩組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。The gene expression level in Tr-CK(control) was normalized to 1. The asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, between two groups (independent samples t-test).

3 討論

目前，在全球范圍內(nèi)植物病原體已經(jīng)帶來了許多毀滅性的病害，而昆蟲媒介負(fù)責(zé)傳播一些世界上最致命的病原體，且某些病原需要特定的昆蟲才能傳播(Suzukietal., 2006)。媒介昆蟲對植物病原體的攜帶主要集中在果蠅或半翅目昆蟲的腸道和唾液腺中(Bassetetal., 2000)。昆蟲對線蟲的攜帶研究主要在昆蟲對寄生性線蟲和昆蟲病原線蟲之間展開(Castilloetal., 2011)。然而，媒介昆蟲對植物病原線蟲的攜帶，尤其是在氣管系統(tǒng)中則鮮有報(bào)道。媒介昆蟲松墨天牛能安全地?cái)y帶成千上萬頭植物病原線蟲——松材線蟲而不影響其壽命，所以研究松墨天牛與松材線蟲間的共生互作關(guān)系十分必要。本研究利用Illumina測序技術(shù)對攜帶與未攜帶松材線蟲的松墨天牛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，在無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序情況下，共獲得55 059條unigenes。其中4 022條unigene在GO數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，6 098條unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。通過分析后發(fā)現(xiàn)松墨天牛攜帶松材線蟲后，差異基因主要為松墨天牛氣管中壓力調(diào)節(jié)、組織與DNA修復(fù)相關(guān)通路，為進(jìn)一步發(fā)掘重要的功能基因奠定基礎(chǔ)。

通過對比攜帶及未攜帶松材線蟲的松墨天牛的氣管、表皮及脂肪體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)除脂肪體外，攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管與表皮組織中的差異表達(dá)基因均以上調(diào)為主，其中尤以氣管中的基因表達(dá)量變化最大，高于其余兩組織中的差異表達(dá)基因總數(shù)及上調(diào)基因數(shù)。對差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析結(jié)果顯示，攜帶松材線蟲的松墨天牛氣管及表皮中富集到的功能通路相一致，且表達(dá)模式也相一致。說明盡管松材線蟲在天牛氣管中被攜帶，昆蟲氣管系統(tǒng)是由外胚層細(xì)胞內(nèi)陷形成，其內(nèi)壁與表皮相連，與表皮構(gòu)造相同，昆蟲表皮及氣管系統(tǒng)都具有一層上皮細(xì)胞且相連，作為昆蟲的第一道防線抵擋外來物侵染。前期研究顯示，松墨天牛對松材線蟲的響應(yīng)過程中，總體上松墨天牛的免疫處于壓制狀態(tài)，表皮和氣管中一部分免疫基因上調(diào)表達(dá)，大部分免疫基因表達(dá)水平不變，松墨天牛通過活性氧調(diào)節(jié)維持二者間免疫穩(wěn)態(tài)(Zhouetal., 2017, 2018)。在本研究中，我們通過進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到大量脅迫響應(yīng)基因在攜帶松材線蟲的松墨天牛中上調(diào)，說明松材線蟲對于松墨天牛更像是一種壓力因子的存在，而不是一種外來侵染物，可能是二者長期協(xié)同進(jìn)化的過程中建立的特殊共生關(guān)系的體現(xiàn)。

根據(jù)KEGG分析及GO分析可看出，當(dāng)松材線蟲進(jìn)入天牛氣管后，表達(dá)量上調(diào)的共濟(jì)失調(diào)蛋白、酪氨酸激酶受體等與DNA修復(fù)和細(xì)胞損傷修復(fù)有關(guān)，其中尤以PABPN1蛋白表達(dá)量變化最為明顯。而CREB結(jié)合蛋白、鋅指蛋白、PABPN1蛋白、RNA結(jié)合蛋白與真核基因表達(dá)調(diào)控以及RNA合成與代謝有關(guān)等方面的基因表達(dá)量增加；同時(shí)作為生殖系干細(xì)胞調(diào)節(jié)基因的核小核糖核蛋白顆粒SmE則與生殖活動(dòng)相關(guān)(Ishigaketal., 2015; Dyson and Wright, 2016; Banerjeeetal., 2017)，而催化活性過程中的上調(diào)的FYVE域蛋白則與激素相應(yīng)和應(yīng)對脅迫壓力方面有潛在作用(Wangetal., 2000; Yaoetal., 2016)。同時(shí)不難看出許多上調(diào)的基因均與DNA復(fù)制、損傷修復(fù)相關(guān)，如Endonuclease V與DNA的損傷修復(fù)相關(guān)；Cystatin-C基因的表達(dá)產(chǎn)物被認(rèn)為對半胱氨酸蛋白酶的局部調(diào)節(jié)有著十分重要的作用；Putative helicase mov-10-B.1作為一種可能的RNA解旋酶，是miRNA介導(dǎo)的基因沉默過程所必需的；而Heat shock protein 75 kD, mitochondrial(precursor)表達(dá)形成的TNFR及其下游激酶則直接與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)與脅迫響應(yīng)有關(guān)(Copeland, 2012)。所以我們推測，作為松材線蟲的傳播媒介，松墨天牛在攜帶松材線蟲后，通過增強(qiáng)遺傳物質(zhì)與細(xì)胞組織修復(fù)及真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面的基因表達(dá)，來提高自身對于松材線蟲的耐受性，抵消松材線蟲寄生所帶來的不利影響，重新維持了自身正常生命穩(wěn)態(tài)，從而為松材線蟲與松墨天牛之間形成共生關(guān)系提供了可能。

本研究從轉(zhuǎn)錄組測序方面探究了攜帶與不攜帶松材線蟲狀態(tài)下的松墨天牛氣管、表皮及脂肪體3個(gè)組織間表達(dá)基因的變化，為探究二者之間的共生關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，為松材線蟲防治工作提供了新的參考思路。后續(xù)我們將對重點(diǎn)差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行分析，更全面深入地解析松墨天牛在攜帶松材線蟲后所發(fā)生的生理變化的分子機(jī)制，為將來的實(shí)際應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。