苗艷麗，廖銘能，楊明珠，梁子健，吳湛霞，梁曉欣，邱慶聰

(廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088)

木瓜蛋白酶(Papain)，又稱木瓜酶，是番木瓜(Carieapapaya)中一種具有廣泛底物專一性的低特異性蛋白水解酶[1]。木瓜蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力非常強(qiáng)，可水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并能優(yōu)先水解那些在肽鍵的N-端具有二個(gè)羧基的氨基酸或芳香 L-氨基酸。具有酶活高、適用pH范圍廣、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，因此在食品、醫(yī)藥、飼料、日化等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但其穩(wěn)定性差，在溫度、pH和無機(jī)離子等外界因素影響下，容易變性失活。酶的固定化通常是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，但是仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并且可以回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。為了提高木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性，研究者們正努力探索酶類藥物的固定化載體和固定化方法。楊頔[1]、李紅[2]、袁春桃等[3]采用了固定化酶的方法，將其固定在合適的載體上，較多報(bào)道的固定化載體為殼聚糖[4]。其他，有李琳、丁利君和劉佳煒等[5-7]分別以竹纖維素、殼聚糖-埃洛石納米管微球和明膠-殼聚糖-海藻酸鈉凝膠為載體研究了其對(duì)木瓜蛋白酶的固定化作用。

固定化酶的載體選擇上天然高分子載體最大的特點(diǎn)是無毒性，有很好的生物相溶性和生物粘連性，近年研究比較熱門的天然高分子載體如殼聚糖(chitosan，CTS)、海藻酸鈉等。而且越來越多的研究者采用具有生物黏附性天然高分子制備而成的微球，作為各種蛋白酶、藥物等活性物質(zhì)的固定化載體。因此，本研究以殼聚糖-海藻酸鈉微球?yàn)檩d體，戊二醛為交聯(lián)劑，通過測定木瓜蛋白酶的活性回收率為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化固定木瓜蛋白酶的條件。通過殼聚糖-海藻酸鈉微球固定化木瓜蛋白酶來提高其穩(wěn)定性，從而擴(kuò)大了木瓜蛋白酶的應(yīng)用范圍；為后期工業(yè)生產(chǎn)推廣打下了基礎(chǔ)；目前相關(guān)研究在國內(nèi)很少見報(bào)道。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試 劑

木瓜蛋白酶(20萬U/g)，廣西南寧龐博生物工程有限公司；殼聚糖，脫乙酰度 90%(分子量約 10 萬)；海藻酸鈉(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；干酪素(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；25%戊二醛(分析純)，國藥集團(tuán)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，均購自國藥集團(tuán)試劑公司。

1.2 儀 器

TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；PHS-2F pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多公司；JB-2恒溫磁力攪拌器，金壇市富華儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 殼聚糖-海藻酸鈉空白微球的制備[8-9]

先將含2%(體積分?jǐn)?shù))司盤-80 的液體石蠟置于60 ℃、500 RPM 水浴鍋中，攪拌均勻作為油相。再將1.5%海藻酸鈉溶液逐滴加入到油相中，攪拌成 O/W型乳劑，用7號(hào)針頭將含適量CaCl2的1% 殼聚糖乙酸溶液滴加到處于攪拌狀態(tài)的乳劑中，滴畢繼續(xù)攪拌 30 min。再加入6%油 相體積的 25%戊二醛溶液，交聯(lián) 2 h，離心 10 min 后棄去上層油相，用乙醇洗滌下層微球后，再用石油醚洗滌微球，加入丙酮分散，常溫干燥即得。

1.3.2 固定化木瓜蛋白酶的制備[10-12]

將殼聚糖-海藻酸鈉空白微球放在 0.2 mol/L pH=7.2的磷酸緩沖液中浸泡 24 h，抽濾，干燥。稱取適量殼聚糖-海藻酸鈉空白微球置于小燒杯中，加入新配制的木瓜蛋白酶溶液適量，吸附4 h，并不時(shí)攪拌，然后滴入戊二醛溶液適量，攪拌交聯(lián) 3 h后，用 0.2 mol/L pH=7.2的磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛溶液和木瓜蛋白酶溶液，直到在275 nm處無吸收峰。抽濾，即得固定化木瓜蛋白酶的殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合微球。

1.3.3 固定化木瓜蛋白酶活性測定[13]

稱取固定化木瓜蛋白酶微球0.1 g置于10 mL具塞比色管中，于(37±0.2)℃水浴中保溫 10 min，加入已預(yù)熱的酪蛋白溶液適量，搖勻，反應(yīng)40 min；加入已預(yù)熱的三氯乙酸溶液5.00 mL，搖勻，反應(yīng)10 min；用干燥濾紙濾過，取濾液，在2 h內(nèi)，在波長為275 nm處用蒸餾水作參比測出濾液的吸光度A1。

稱取固定化木瓜蛋白酶微球0.1 g置于10 mL具塞比色管中，于(37±0.2)℃水浴中保溫 10 min，加入已預(yù)熱的三氯乙酸溶液5.00 mL，搖勻，反應(yīng)10 min，加入已預(yù)熱的酪蛋白溶液適量，搖勻，反應(yīng) 40 min，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，在 2 h內(nèi)，在波長為 275 nm 處用蒸餾水作參比測出濾液的吸光度A2。

用蒸餾水作參比，在波長 275 nm 處測定 50 μg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A3。

根據(jù)以下公式計(jì)算結(jié)果：

試樣中木瓜蛋白酶活力X1(U/g)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A1——試樣溶液的吸光度

A2——空白試驗(yàn)的吸光度

A3——酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度

m1——對(duì)照品溶液中每毫升含酪氨酸的量，μg

m2——試樣的質(zhì)量，g

n——試樣溶液的稀釋倍數(shù)

U(g)表示固定化酶活力，回收率按下式計(jì)算：

1.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶固定化條件

為了探求每個(gè)因素對(duì)固定化木瓜蛋白酶的影響，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法擬合優(yōu)化，得到固定化木瓜蛋白酶的最佳工藝。以A(殼聚糖與海藻酸鈉的配比)，B(加酶量)，C(戊二醛濃度)，D(固定化溫度)為自變量(表1)，以固定化木瓜蛋白酶活性回收率為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法進(jìn)行多元線性回歸擬 合，優(yōu)化固定化條件，進(jìn)行預(yù)測分析，實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)表1進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

表1 木瓜蛋白酶固定化條件

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)木瓜蛋白酶活性測定結(jié)果

續(xù)表2

8145 76001.5040.0181.830.324155 77001.2540.0395.156.415165 75001.5032.5268.753.72175 55001.2532.5126.425.35183 76001.0025.0197.632.920195 56001.5032.586.914.512205 56001.2540.0403.067.24215 57001.2532.5331.947.49223 76001.2525.0126.421.123235 75001.2540.0197.639.57245 76001.0040.0308.251.416255 77001.5032.5118.516.9

2 結(jié)果與討論

2.1 各因素模型擬合圖以及工藝優(yōu)化分析

2.1.1 各因素對(duì)酶活性回收率的影響

以考察指標(biāo)擬合的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，描繪等高線圖，固定4個(gè)變量，2個(gè)為中心點(diǎn)值，其余2個(gè)考察對(duì)象為相應(yīng)考察指標(biāo)，代入目標(biāo)函數(shù)方程，繪制等高線圖，結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 CS與SA的配比對(duì)酶活性回收率的影響

圖2 加酶量對(duì)酶活性回收率的影響

圖1中曲線為凸形，在 18%～24%之間。可見殼聚糖(CS)與海藻酸鈉(SA)的配比對(duì)酶活性回收率的影響并不大，且中點(diǎn)右邊比左邊高，可知質(zhì)量比為3:7的微球?qū)潭感ЯΣ淮?。圖2中曲線為凹形，在 20%～40%之間?？梢娂用噶繉?duì)酶活性回收率的影響較顯著，中點(diǎn)右邊，隨著加酶量增大，酶活性回收率也隨之增大；但在中點(diǎn)左邊，酶活性回收率隨著加酶量增大反而減小。

圖3 戊二醛濃度對(duì)酶活性回收率的影響

圖4 固定化溫度對(duì)酶活性回收率的影響

由圖3中曲線為凹形，在 27%～30%之間?？梢娢於舛葘?duì)酶活性回收率的影響并不大，中點(diǎn)右邊酶活性回收率基本不隨戊二醛濃度的增大而變化，而左邊酶活性回收率則隨著戊二醛濃度的增大而減少。圖4中曲線為凹形，在 27%～42%之間?？梢姽潭ɑ瘻囟葘?duì)酶活性回收率的影響顯著，中點(diǎn)右邊酶活性回收率隨著固定化溫度增大而顯著增大，而左邊酶活性回收率隨著固定化溫度增大先減少后又增大。

2.1.2 各影響因素的交互作用

CS與SA的配比(A)和加酶量(B)、CS與SA的配比(A)和固定化溫度(D)、加酶量(B)和戊二醛濃度(C)、加酶量(B)和固定化溫度(D)之間的交互作用的等高線圖分別如圖5～圖8所示。

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，等高線越密集，說明二者交互作用越顯著，等高線越疏則相反，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反[14]。

圖5 CS與SA的配比和加酶量之間的交互作用

圖6 CS與SA的配比和固定化溫度之間的交互作用

由圖5中等高線的分布可知，CS與SA的配比(A)和加酶量(B)的交互作用比較顯著。酶活性回收率最高點(diǎn)在右上角?？芍|(zhì)量比為 3:7(0.43)時(shí)，隨加酶量的增加酶活性回收率稍有增大；當(dāng)質(zhì)量比為 5:5(1.00)時(shí)，酶活性回收率隨加酶量的增加而顯著增大。酶活性回收率的變化隨著CS與SA的配比的變化小于加酶量的變化，說明加酶量對(duì)酶活性回收率的影響較大。由圖6中等高線的分布可知，CS與SA的配比(A)和固定化溫度(D)之間的交互作用比較顯著。酶活性回收率最高點(diǎn)在右上角?？芍|(zhì)量比為3:7(0.43)時(shí)，酶活性回收率隨固定化溫度的增大而增大，但在28 ℃以上并不顯著；質(zhì)量比為5:5(1.00)時(shí)，酶活性回收率隨固定化溫度增大而有較顯著的增大。

由圖7中等高線的分布可知，加酶量(B)和戊二醛濃度(C)之間交互作用比較顯著。酶活性回收率最高點(diǎn)在右下角，而左上角也出現(xiàn)了較高點(diǎn)。加酶量為500 U/mL時(shí)，酶活性回收率隨戊二醛濃度的增大而增大；加酶量為700 U/mL時(shí)，酶活性回收率隨戊二醛濃度的增大而顯著減少。由圖 8中等高線的分布可知，加酶量(B)和固定化溫度(D)之間交互作用比較顯著。酶活性回收率最高點(diǎn)在右上角。加酶量為500 U/mL時(shí)，酶活性回收率隨固定化溫度增大的變化并不顯著；加酶量為700 U/mL 時(shí)，酶活性回收率隨固定化溫度增大而增大。

圖7 加酶量和戊二醛濃度之間的交互作用

圖8 加酶量和固定化溫度之間的交互作用

2.2 最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

由一系列實(shí)驗(yàn)測試所得數(shù)據(jù)通過 Design-Expert 軟件的擬合，預(yù)測固定木瓜蛋白酶的最優(yōu)條件為：A(殼聚糖與海藻酸鈉的配比)為 5:5、B(加酶量)為700 U/mL、C(戊二醛濃度)為 1.0%、D(固定化溫 度)為 40 ℃，酶活性回收率為69.05%。

按照“1.3.2”項(xiàng)下的最佳條件進(jìn)行木瓜蛋白酶的固定化試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到木瓜蛋白酶的活性回收率分別為：68.70%、69.00%、69.10%，平均值為68.93%，與預(yù)測值69.05%接近。該預(yù)測值與實(shí)際值非常接近，說明回歸模型建立的準(zhǔn)確可靠，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

2.3 固定化木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 溫度實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過在不同溫度和不同pH條件下測試固定化木瓜蛋白酶進(jìn)行穩(wěn)定性研究。按照“3.2”項(xiàng)下的最佳條件進(jìn)行木瓜蛋白酶的固定化實(shí)驗(yàn)，取一定量的固定化酶分別置于室溫(25±2)℃、高溫(40±1)℃的環(huán)境中，每隔一定的時(shí)間(1、3、5 d)分別測定固定化木瓜蛋白酶的活性，計(jì)算出酶活性回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同貯存溫度對(duì)固定化酶活性回收率的影響

由表3可見，固定化產(chǎn)物在室溫(25±2)℃、高溫(40±1)℃的條件下5 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，相較于自由凝血酶固定化的凝血酶穩(wěn)定性顯著提高，貯存時(shí)間顯著延長。

2.3.2 酸堿度實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過在不同pH條件下測試固定化木瓜蛋白酶進(jìn)行穩(wěn)定性研究。按照“2.2”項(xiàng)下的最佳條件進(jìn)行木瓜蛋白酶的固定化實(shí)驗(yàn)，取一定量的固定化酶分別置于pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖溶液溶解浸泡，在室溫放置 72 h，分別測定固定化木瓜蛋白酶的活性，計(jì)算出酶活性回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 不同 pH 對(duì)固定化酶活性回收率的影響

由表4可知，固定化菠蘿蛋白酶對(duì)酸堿度比較敏感，pH為7.0時(shí)酶活性回收率最好。

3 結(jié) 論

以殼聚糖和海藻酸鈉為原材料，采用乳化交聯(lián)法制備空白微球。將殼聚糖-海藻酸鈉空白微球吸附木瓜蛋白酶并通過戊二醛固定，測定固定化木瓜蛋白酶的活性回收率為最終指標(biāo)。用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)其優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。通過進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果表明最優(yōu)條件為：A(殼聚糖與 海藻酸鈉的質(zhì)量配比)為 5:5、B(加酶量)為 700 U/mL、C(戊二醛濃度)為 1.0%、D(固定化溫度)為 40 ℃。后又通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)得出貯存溫度為 25.0 ℃，貯存酸堿度為 7.0。木瓜蛋白酶的固定化效果良好，酶活性回收率為 68.9%。