姚麗萍 原小慧 劉杰 王曉榮 盧志山

根管消毒是根管治療術(shù)的重要步驟，通過根管消毒起到進一步殺滅根管機械預(yù)備后根管內(nèi)殘余細菌。藥物消毒是最常用的根管消毒方法，氫氧化鈣是目前最主要的根管內(nèi)消毒藥物[1]。有研究表明，由于氫氧化鈣滲入牙本質(zhì)小管深度有限，導致其不能持續(xù)有效的殺菌[2]、對糞腸球菌和白色念珠菌的抑菌效果較差，對生物膜的效果也存在爭議[3]，而且，氫氧化鈣糊劑封藥后難以徹底清除，影響根管充填封閉的嚴密性[4]。有必要進一步探尋安全、高效的根管消毒藥物以抑制根管預(yù)備后根管系統(tǒng)中殘余細菌并殺滅已經(jīng)形成生物膜的細菌。

納米銀微粒具備超強的抗菌能力，可以殺死包括金黃色葡萄球菌、肺炎桿菌、大腸桿菌等在內(nèi)的多種細菌以及真菌、支原體、衣原體等致病微生物材料和方法[5]，與傳統(tǒng)抗生素相比極少產(chǎn)生耐藥性是一很大的優(yōu)勢[6]。研究表明，納米銀對離體牙牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜有較強的滲透能力和殺菌作用，其殺菌作用隨處理時間的延長而增強，是一種新型有效的根管消毒藥物[7]。納米銀制劑在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，在口腔潰瘍[8]、種植體表面涂層[9]、樹脂材料[10]等方面的研究正逐步深入，本實驗通過構(gòu)建Beagle犬慢性根尖周炎動物模型，探討0.1%納米銀溶液作為根管封藥對根尖周病變愈合情況、及根尖周組織炎癥刺激性的影響，以期為探尋新型有效的根管消毒藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實驗動物

3 只12 個月齡，體重在10～12 kg的成年Beagle犬(儀征安立卯生物科技有限公司),無齲齒及牙周病；納米銀(粒徑60～120 nm，上海麥克林試劑)；CBCT(合肥美亞光電技術(shù)有限公司)；便攜式電動牙鉆機、ProTaper鎳鈦根管、直徑1 mm球鉆(Dentsply公司，美國)；速眠新II(敦化市圣達動物藥品有限公司)；次氯酸鈉(天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司)；氫氧化鈣(天津中鼎生物醫(yī)學科技有限公司)；總RNA提取試劑盒(B511321，上海生工)；SYBRGreen PCR試劑盒(AQ131)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AE311，北京全式金)。

1.2 比格犬慢性根尖周炎動物模型的構(gòu)建

本實驗通過動物倫理委員會認證。按照每公斤0.08～0.10 ml的劑量，對Beagle犬進行肌肉注射速眠新II，待犬均完全麻醉后將四肢固定于手術(shù)臺上，采取仰臥位，用75%的乙醇于右側(cè)上下頜區(qū)域進行內(nèi)外消毒，然后在上頜第二、第三前磨牙，下頜第二、第三、第四前磨牙頰舌側(cè)注射5%利多卡因5 ml，進行局部浸潤麻醉。按照Silva等[11]的方法構(gòu)建犬慢性根尖周炎動物模型。將上述共30 顆前磨牙開髓，給予拔髓，開放于口腔中7 d，使細菌感染根管。 7 d后，按照上述方法全麻下，使用Fuji玻璃離子封閉開髓口。在45 d左右完成模型建立。

拍攝CBCT(89 kV， 10 mA， 掃描時間15 s)，將掃描后圖像數(shù)據(jù)(DICOM格式)導入計算機配置為Dell Precision T7600臺式工作站(中央處理器E5-2643，內(nèi)存32 G DDR3，Win7旗艦版64位操作系統(tǒng))，軟件Mimics 21(Materialise，Leuven，比利時)進行牙齒及根尖周透射影的三維重建，并測量根尖周透射影的體積。

1.3 實驗分組

將上述建立的30 顆Beagle犬慢性根尖周炎前磨牙，隨機分為3 組，每組10 顆牙齒，分別為0.1%納米銀溶液組、氫氧化鈣組、空白對照組。

1.4 根管預(yù)備及根管封藥

將Beagle犬全麻，去除暫封物，依據(jù)CBCT中牙尖到根尖止點距離減去1 mm作為工作長度，采用冠向下法，使用ProTaper旋轉(zhuǎn)鎳鈦銼進行根管預(yù)備至F1。1%次氯酸鈉沖洗，無菌紙尖干燥根管。按照下列的方法進行根管封藥：① 0.1%納米銀溶液組：將0.1 g納米銀粉放入100 ml去離子水中，超聲震蕩20 min，制成0.1%納米銀懸濁液。使用1 ml、 規(guī)格27 號針頭無菌注射器將納米銀溶液注入根管內(nèi)，使用15#K銼上下提拉20 次，去除氣泡，再次注入溶液，直到注滿為止； ②氫氧化鈣組：將齒科用氫氧化鈣粉末與溶液調(diào)制成糊狀，用螺旋輸送器導滿根管； ③空白對照組：干燥根管后，根管內(nèi)未封藥物，直接充填。

每顆牙齒根管封藥后使用Fuji玻璃離子墊底，3M Z350樹脂封閉開髓孔。

1.5 拍攝術(shù)后CBCT

根管封藥4 周后，全麻后拍攝CBCT，使用軟件Mimics 21進行牙齒及根尖周透射影的三維重建，測量根尖周牙槽骨破壞體積。

1.6 Real-time PCR檢測IL-6的表達

拍攝完成CBCT后將動物處死,拔除實驗牙后用挖匙刮取牙槽窩內(nèi)的根尖周組織,利用總RNA提取試劑盒提取根尖周組織中的總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA，反應(yīng)在Real-time PCR檢測儀(羅氏LC96)上進行，內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及IL-6引物序列見表1。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，62 ℃退火35 s，共40 個循環(huán)，溶解曲線97 ℃10 s， 65 ℃ 60 s， 97 ℃1 s。PCR擴增后，實時熒光定量PCR儀自動分析結(jié)果，根據(jù)陰性對照調(diào)整閾值和基線以確定各個標本的Ct值，并根據(jù)熔解曲線確定該Ct值是否有效。將結(jié)果導出，采用2-ΔΔCT法分析目的基因在對照組和各測定組之間的表達差異，計算公式如下： ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參， 再求得對照組ΔCt的平均值，記為ΔCt對照平均，用各組的ΔCt分別減去ΔCt對照平均， 求得ΔΔCt值，即ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對照平均， 再計算各組2-ΔΔCT值，即為各組中基因的相對表達量。

表1 GAPDH及IL-6引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 Beagle犬慢性根尖周炎動物模型的構(gòu)建

將Beagle犬前磨牙開放7 d后封閉開髓孔，經(jīng)過45 d后，拍攝CBCT，獲得DICOM格式的圖像數(shù)據(jù)。利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像(圖1)，可見犬前磨牙均出現(xiàn)根尖周組織破壞，成功構(gòu)建Beagle犬慢性根尖周炎動物模型。

圖1 Beagle犬慢性根尖周炎模型三維重建圖

2.2 根管封藥4周后各組根尖周組織破壞區(qū)的重建及其比較

根管封藥 4周后，再次拍攝CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像(圖2)。

圖2 根管預(yù)備并封藥前后對比根尖周組織破壞三維重建圖

根管封藥4 周后，再次拍攝CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像。利用Mimics軟件測量各牙齒根尖周破壞的體積(表2)。結(jié)果顯示：根管預(yù)備后，各組封入不同根管封藥，其根尖周破壞的體積都較術(shù)前縮??；0.1%納米銀溶液組根管封藥后根尖周陰影的體積與術(shù)前相比，具有顯著性差異(P<0.01)，氫氧化鈣組根管封藥后與術(shù)前相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而空白對照組術(shù)前與術(shù)后相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 根尖周破壞體積術(shù)前術(shù)后的比較

Tab 2 Comparison of the lesion volume before and after intracanal medicament (n=20, mm3)

表2 根尖周破壞體積術(shù)前術(shù)后的比較

組 別術(shù)前術(shù)后t值P值0.1%納米銀11.80±5.00 6.11±2.57 4.5280.000氫氧化鈣11.20±4.09 8.55±4.06 2.0560.047空白組10.68±3.72 7.78±2.34 2.9490.050

2.3 Beagle犬慢性根尖周炎動物模型根尖周IL-6 mRNA的表達

0.1%納米銀溶液組、氫氧化鈣組、空白對照組根尖周組織中IL-6 mRNA相對表達量分別為0.009(0.005,0.08)、0.324(0.06,0.794)、0.011(0.004, 0.054)(表3)，不同組間IL-6 mRNA相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 根尖周組織IL-6 mRNA表達量的比較 (n=10)

3 討 論

盡管根管治療術(shù)是目前治療牙髓病和根尖周病最有效的方法，但由于根管系統(tǒng)的解剖復(fù)雜性，機械預(yù)備和化學預(yù)備無法達到所有側(cè)副根管和細小彎曲根管等部位，影響了根管治療的成功率。研究表明，細菌能以生物膜的形式生存于低氧張力和低營養(yǎng)環(huán)境中并附著在根管峽部和牙本質(zhì)小管內(nèi)以及其他結(jié)構(gòu)表面[12]。為提高根管治療的成功率，應(yīng)殺滅這些生物膜細菌，目前最常用的根管消毒藥物為氫氧化鈣。然而，也有學者研究認為其抑菌深度和抑菌效果較差[3]。因此，尋找安全、高效的根管消毒藥物是牙髓病學者們提高根管治療成功率的重要途徑。

氫氧化鈣是目前最常用的根管內(nèi)消毒藥物，其具有很強的抗菌活性、能夠滅活殘留在根管壁上的細菌內(nèi)毒素、通過促進堿性磷酸酶活性和礦化組織形成有利于根尖周組織的修復(fù)。本實驗中，成功構(gòu)建了Beagle犬慢性根尖周炎動物模型，為進一步研究根管內(nèi)封藥提供了動物模型。實驗中，氫氧化鈣封藥組的根尖周陰影體積較術(shù)前縮小，差異有統(tǒng)計學意義，這充分說明氫氧化鈣有促進根尖周病變愈合的作用。感染根管經(jīng)過機械和化學預(yù)備后需要根管封藥以進一步消除殘留細菌和毒素，而在根管充填前應(yīng)徹底清除這些封藥，否則會降低根管封閉劑向牙本質(zhì)小管滲透，影響其封閉效果，增加了根尖滲漏的風險。Laky等[4]研究了光子誘導光聲流技術(shù)(photon-induced photo- acoustic streaming，PIPS)去除根管內(nèi)氫氧化鈣的效果，結(jié)果表明PIPS對根管內(nèi)氫氧化鈣的清除效果非常明顯，較其它方法具有不可比擬的優(yōu)點。但是由于PIPS技術(shù)需要專門的激光設(shè)備，因此限制了其臨床應(yīng)用。

為了進一步尋找安全、高效的根管消毒封藥，在本實驗中進一步探討了0.1%納米銀溶液用于犬慢性根尖周炎動物模型根管封藥的作用。納米銀具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)等特性，還具有超強的抑菌殺菌能力，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。研究表明，納米銀濃度越高，其抑菌效果越明顯，相對細胞毒性就越高[13]。Holla等[14]發(fā)現(xiàn)納米銀溶液對變形鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)為40 μg/ml；張富強等[15]發(fā)現(xiàn)濃度在25 g/L以下的納米銀粒子沒有細胞毒性。董立民等[16]發(fā)現(xiàn)對糞腸球菌的MIC為37.5～75 μmol/L，而對鏈球菌MIC為18.75～37.5 μmol/L。張富華等[17]發(fā)現(xiàn)0.1%的納米銀溶液抑菌效果高于2%的次氯酸鈉溶液，Samiei等[18]應(yīng)用納米銀凝膠用于抑制牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌，由于其流動性受限制，納米銀凝膠的抑菌效果并不突出；劉奕等[19]發(fā)現(xiàn)載銀納米羥磷灰石抑制糞腸球菌的作用較好。雖然有很多的學者研究了納米銀的體內(nèi)殘留及累積問題，但目前還沒有學者對納米銀制劑載體在根管內(nèi)的可能殘留問題及影響根管充填嚴密性的研究，所以本實驗采用了0.1%濃度(100 μmol/L)的納米銀溶液，結(jié)果表明，封藥后根尖周破壞體積明顯縮小(P<0.01)，促進了根尖周病變的愈合。通過本研究證明，0.1%納米銀溶液進行根管消毒封藥，不僅能夠達到根管內(nèi)消毒的作用，而且由于自身是液體，能夠容易去除，從而避免氫氧化鈣根管封藥后難以清除的缺點。

IL-6和TNF-α是引起根尖周骨質(zhì)破壞的重要炎癥因子，IL-6通常被推薦用來檢測慢性根尖周炎的炎癥程度[20]，而且楊文東等[21]的研究表明IL-6 mRNA的表達水平與病體積損關(guān)系不大。納米銀制劑的抑菌效果明顯，其生物毒性一直是制約其廣泛使用的關(guān)鍵因素。通過本研究證明0.1%納米銀溶液組根尖周組織中的IL-6 mRNA的相對表達量與氫氧化鈣糊劑及空白對照組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明0.1%納米銀溶液對根尖周組織的炎癥刺激性不明顯?？傊?.1%納米銀溶液與氫氧化鈣相比，能有效促進犬慢性根尖周炎根尖周組織的愈合，且對根尖周組織無明顯炎癥刺激作用。本實驗的局限性在于僅探討了根管預(yù)備后0.1%納米銀溶液和氫氧化鈣封藥效果的比較，并不能代表整個根管治療過程。在后期的實驗中應(yīng)該進一步探尋納米銀應(yīng)用的最佳濃度、最佳粒徑，使其發(fā)揮最佳抑菌和殺菌效果，為在臨床中應(yīng)用于根管消毒封藥提供理論依據(jù)。