婁紅軍 都 玉 李金峰 李 剛

中國衛(wèi)生部公布的《保健食品功能學(xué)評價程序和檢測方法》中規(guī)定的抗疲勞、耐低溫、耐缺氧作用的基本試驗項目都是以動物試驗研究評價的。因此我們進行功效特性評價時，嚴(yán)格控制影響試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的主觀因素和客觀因素，保證評價結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，并提高其試驗結(jié)果的重現(xiàn)性。為此，我們根據(jù)犬的生理及現(xiàn)代中草藥藥理研究抗高原反應(yīng)的科研成果，按中醫(yī)理論組方，研制出純中草藥添加劑，主要成分包括：紅景天、黃芪、當(dāng)歸、玫瑰花等;并根據(jù)各成份的用途、功能進行組方，科學(xué)設(shè)計；保證其質(zhì)量同時，兼顧與維生素、微量元素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)之間的協(xié)同性與頡頏性。經(jīng)反復(fù)試驗證明，該中草藥添加劑具有抗疲勞、耐低溫、耐缺氧的功能，能增強機體免疫功能、促進血液循環(huán)及新陳代謝的作用，能降低高原反應(yīng)對犬的影響。為了驗證其抗疲勞、耐低溫、耐缺氧功能，并對其效果進行研究、評價，為該中草藥添加劑的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和研究依據(jù),特做如下試驗。

一、材料與方法

（一）主要試劑及儀器設(shè)備

1. 中草藥添加劑

該中草藥添加劑以紅景天為主藥，輔以黃芪、當(dāng)歸、枸杞、玫瑰花等幾味中草藥，按比例配伍、加工而成。

2. 試劑、儀器設(shè)備

表1 主要試劑與儀器設(shè)備

3.實驗動物與飼養(yǎng)管理

選擇健康、未曾交配、體況相近的ICR 小鼠，體重20g±2g，共320 只，其中雄性160 只、雌性160 只，由南京盛民科研動物養(yǎng)殖場提供。飼養(yǎng)條件達(dá)到實驗動物建筑設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)、實驗動物飼育空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境噪聲標(biāo)準(zhǔn)，室溫溫差24℃±5℃，相對濕度60%±20%，明/暗時間12h/12h。鼠糧、墊料由南京盛民科研動物養(yǎng)殖場提供。

4.實驗設(shè)計

（1）受試小鼠的隨機分組及灌胃設(shè)計

小鼠檢疫后適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，給藥前禁食8h，給藥后禁食4h，但不限制飲水。將320 只小鼠隨機分配到對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。以警犬每日推薦攝入量（0.2g/kg）的5 倍、10 倍、20 倍作為低、中、高劑量，即低劑量組（1g·kg-1·d-1）、中劑量組（2g·kg-1·d-1）、高劑量組（4g·kg-1·d-1），對照組灌以等量生理鹽水。每日定時灌胃，連續(xù)7d，排除因灌胃損傷意外死亡的小鼠后，進行各項實驗。

（2）小鼠負(fù)重游泳實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后稱重，在每只小鼠背部固定5%體重的鉛墜，松緊度適宜，立刻將各組小鼠分別置于游泳箱中游泳，控制水深不低于30cm、水溫24℃±0.5℃、且使小鼠均無支持物攀附、持續(xù)游泳。立即按下秒表，觀察各組小鼠游泳情況，準(zhǔn)確記錄小鼠從入水至力竭（小鼠頭部完全沉入水中10s不起）的時間，即為小鼠負(fù)重游泳時間。

（3）小鼠運動后肝糖原、全血乳酸、血尿素氮含量實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后，立刻將各組別小鼠分別置于游泳箱中無負(fù)荷游泳，控制水深不低于30cm、水溫24℃±0.5℃、且使小鼠均無支持物攀附。準(zhǔn)確計時使小鼠游泳90min 后取出，立即進行眼球采血，裝入混有抗凝劑（肝素鈉）的離心管中。取血后脫頸椎處死，剖解小鼠后取新鮮肝臟。按照試劑盒說明書測定樣本肝糖原、血LD、BUN 水平。

（4）小鼠低溫存活時間實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后，立刻將所有小鼠混裝于鐵絲籠中并置于-20℃冰箱中，20 min 后每隔1min 觀察小鼠存活情況，記錄各組小鼠死亡數(shù)量。

（5）小鼠常壓耐缺氧存活時間實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后，立刻將每只小鼠分別置于裝有25g 堿石灰（干燥劑）的250mL 廣口瓶中，并用膏狀白凡士林完全封閉瓶口。觀察并記錄各組小鼠狀況，準(zhǔn)確記錄小鼠死亡（心跳呼吸完全停止）時間，即為小鼠常壓耐缺氧存活時間。

（6）小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后，將小鼠乙醚麻醉，用手術(shù)剪立刻從小鼠雙耳連線處斷頭處死，準(zhǔn)確記錄小鼠自斷頭至張口喘氣完全停止的時間，即為小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間。

（7）小鼠亞硝酸鈉中毒后存活時間的實驗

分別從對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組中各取10 只小鼠，選擇嚴(yán)格遵循隨機原則，雌雄各半。在末次給藥30min 后，稱重，按照230mg/kg 的劑量逐只腹腔注射NaNO2，準(zhǔn)確記錄小鼠自注射至心跳呼吸停止的時間，即為小鼠NaNO2中毒存活時間。

5. 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)錄入EXCEL 軟件進行初步處理，后采用SPSS24.0 統(tǒng)計軟件進行t 檢驗。實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。差異判斷標(biāo)準(zhǔn)為：P＜0.05表示差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義，0.05＜P＜0.1 表示差異趨于顯著。

二、結(jié)果

（一）中草藥添加劑抗疲勞效果研究

1. 對負(fù)重游泳時間的影響

各組別小鼠負(fù)重游泳時間統(tǒng)計結(jié)果如表2 所示?？傮w來看，相比較空白對照組，3 個實驗組小鼠負(fù)重游泳時間均顯著延長，其中高劑量組延長率最高達(dá)73.60%，差異極顯著（P＜0.01）。

注：＊表示實驗組與對照組相比，差異顯著（0.01＜P＜0.05）；＊＊表示實驗組與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

2. 對肝糖原值的影響

各組別小鼠運動后肝糖原含量統(tǒng)計結(jié)果如表3 所示。總體來看，3 個實驗組肝糖原含量均明顯高于空白對照組，其中中劑量組、高劑量組差異極顯著（P＜0.01），肝糖原增長率分別達(dá)242.35%、198.43%。

表3 肝糖原含量（x±SD, n=10）

3. 對全血乳酸含量的影響

各組別小鼠運動后全血LD 含量統(tǒng)計結(jié)果如表4 所示?？傮w來看，3 個實驗組LD 含量均明顯低于空白對照組，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01），其中中劑量組降低率達(dá)32.56%，差異極顯著（P＜0.01）。

表4 全血乳酸含量（x±SD, n=10）

4. 對血尿素氮含量的影響

各組別小鼠運動后血BUN 統(tǒng)計結(jié)果如表5 所示?？傮w來看，3 個實驗組血BUN 含量均低于空白對照組，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01），其中低劑量組血BUN 含量最低，降低率為18.48%，且與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。

表5 血尿素氮含量（x±SD, n=10）

（二）中草藥添加劑耐低溫效果研究

各組別小鼠低溫存活時間統(tǒng)計結(jié)果如表6 所示?？傮w來看，相比較空白對照組，3 個實驗組小鼠低溫存活時間均明顯延長，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01），其中低劑量組延長率最高達(dá)26.92%，差異極顯著（P＜0.01）。

表6 低溫存活時間（x±SD, n=10）

（三）中草藥添加劑耐缺氧效果研究

1. 對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響

常壓缺氧主要對心肌、腦造成損傷后致死。在實驗初期，各組小鼠均表現(xiàn)為在陌生環(huán)境中的好奇、試探；隨著實驗進行，可見小鼠被毛雜亂、呼吸迫促、抓撓瓶底、試圖尋找出口，且排尿排糞量均有所增加；在實驗?zāi)┢冢∈蠛粑兟儨\，被毛完全打濕、伏在瓶底幾乎不動。統(tǒng)計各組別小鼠常壓缺氧存活時間如表7所示?？傮w來看，相比較空白對照組，3 個紅景天實驗組小鼠缺氧存活時間均明顯延長，其中中劑量組延長率最高達(dá)35.68%，差異極顯著（P＜0.01），具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表7 常壓耐缺氧存活時間（x±SD, n=10）

2. 對小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間的影響

各組別小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間統(tǒng)計結(jié)果如表8 所示。總體來看，相比較空白對照組，3 個實驗組小鼠腦缺血性缺氧存活時間均顯著延長，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01），其中中劑量組延長率最高達(dá)47.63%，差異極顯著（P＜0.01）。

表8 腦缺血性缺氧存活時間（x±SD, n=10）

3. 對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響

各組別小鼠NaNO2中毒存活時間統(tǒng)計結(jié)果如表9 所示。總體來看，相比較空白對照組，3 個實驗組小鼠亞硝酸中毒存活時間均明顯延長，其中中劑量組延長率最高達(dá)35.24 %，差異極顯著（P＜0.01）。

表9 亞硝酸鈉中毒存活時間（x±SD, n=10）

三、討論

綜合評定該中草藥添加劑的抗疲勞、耐低溫、耐缺氧作用統(tǒng)計分析結(jié)果如表10。

表10 抗高原反應(yīng)中藥方劑抗疲勞、耐低溫、耐缺氧作用綜合評定

（一）抗疲勞效果

疲勞的產(chǎn)生是一個極為復(fù)雜的過程，從能量代謝系統(tǒng)方面來看，“能源物質(zhì)耗竭學(xué)說”現(xiàn)已被世界公認(rèn)。該學(xué)說是指為滿足運動能量需求，人體供能物質(zhì)如脂肪、糖原等不斷分解而儲量驟減，短時間內(nèi)得不到補充，機體正常能量來源的原有平衡被打破，作為3 大供能物質(zhì)的組織蛋白被迫分解以補充能量缺口，便會代謝積累大量BUN 堆積在血液中。同時長時間運動使肌肉無氧酵解，堆積大量乳酸阻斷了神經(jīng)興奮性傳遞，所以疲勞狀態(tài)下身體原有的興奮性和機能下降，肌肉收縮能力和耐力下降。在抗疲勞效果實驗中，相比較空白對照組，3 個實驗組負(fù)重游泳時間顯著延長，運動后肝糖原值增高、血BUN 和LD 含量降低，4 項實驗結(jié)果均顯示陽性，可判定該中草藥添加劑能夠調(diào)節(jié)能量代謝、降低機體耗能、減輕乳酸堆積、緩解肌肉疲勞、增強運動耐力，具有較好的抗疲勞效果。

（二）耐低溫效果

在耐低溫效果實驗中，相比較空白對照組，3 個實驗組低溫存活時間顯著延長，結(jié)果陽性可判定該中草藥添加劑能夠加速機體對寒冷條件的適應(yīng)，具有較好的抗寒冷、耐低溫效果。

（三）耐缺氧效果

當(dāng)小鼠斷頭后，盡管心臟供血停止，但腦部尚存的血液及營養(yǎng)物質(zhì)可供短時間利用，維持短暫的呼吸功能；而NaNO2屬于強氧化劑，當(dāng)中毒劑量的NaNO2進入血液后，F(xiàn)e2+轉(zhuǎn)化Fe3+，血紅蛋白運氧受阻，導(dǎo)致組織缺氧甚至死亡，皮膚表現(xiàn)為青紫色。在耐缺氧效果實驗中，相比較空白對照組，3個實驗組常壓缺氧、腦缺血性缺氧、亞硝酸鈉中毒存活時間均顯著延長，4 項實驗結(jié)果均顯示陽性，可判定該中草藥添加劑能夠改善機體心肌、腦缺氧，減少應(yīng)激損傷，具有較好的耐缺氧效果。

（四）劑量對比

在抗疲勞效果實驗中，該中草藥添加劑中劑量組效果最為明顯；在耐低溫效果實驗中，低劑量組效果最為明顯；在耐缺氧效果實驗中，中劑量組效果最為明顯。