李鑫 郭冉 楊娟 張瑜 楊毅清 馬樹杰 安鑫龍 張利輝 董金皋 張林旺

摘要：為了尋找高效安全的微生物除草劑，來減少或代替部分化學(xué)除草劑的使用，本研究?jī)?yōu)化了黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1的培養(yǎng)條件，并采用顆粒劑填埋法結(jié)合除草劑土壤封閉法測(cè)定了Ha1顆粒劑與化學(xué)除草劑復(fù)配的除草活性。結(jié)果顯示，Ha1菌株培養(yǎng)的最優(yōu)碳源、氮源和無機(jī)鹽及其配比為蔗糖10 g/L、蛋白胨20 g/L、氯化鈣 1 mol/L;最優(yōu)培養(yǎng)條件：pH值為7、溫度為20 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min。添加助劑比未添加助劑的Ha1顆粒劑的活菌數(shù)多0.9×109 CFU/g。當(dāng)Ha1顆粒劑與70%推薦劑量的莠去津、精異丙甲草胺和撲草凈復(fù)配使用時(shí)，對(duì)馬唐的鮮重抑制率分別為96.35%、94.47%、97.61%，對(duì)稗草的鮮重抑制率分別為89.81%、86.50%、85.68%，對(duì)苘麻的鮮重抑制率分別為86.92%、79.53%、53.03%。表明添加助劑有助于菌株生長(zhǎng)，化學(xué)除草劑與Ha1顆粒劑復(fù)配使用能夠明顯提高單獨(dú)使用除草劑或者Ha1顆粒劑的防除效果。

關(guān)鍵詞：黏質(zhì)沙雷氏菌;除草活性;鮮重抑制率;化學(xué)除草劑;復(fù)配

中圖分類號(hào)：S482.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號(hào)：1003-935X（2020）02-0021-12

Abstract：In order to find efficient and safe microbial herbicides to reduce or replace the use of chemical herbicides，the culture conditions of Serratia marcescens Ha1 were optimized. Its herbicidal activity was determined. The optimal nutrient sources，carbon，nitrogen and inorganic salts，and their ratio for Ha1 bacteria were as follow： sucrose 10 g/L， peptone 20 g/L，calcium chloride 0.1 mol/L. Optimal culture conditions consisted of pH 7，temperature 20 ℃，rotating speed 200 r/min. The count of active bacteria in HA1 granules with additives was 0.9×109 CFU/g more than that of HA1 without additives. The fresh weight inhibition rates of the application of Ha1 granules compounding with atrazine，metolachlor and prometryn at 70% recommended dose on Digitaria sanguinalis were 96%，94% and 98%，respectively. The fresh weight inhibition rates on Echinochloa crus-galli were 90%，86% and 86%，respectively. Fresh weight inhibition rates for Abutilon theophrasti were 87%，80% and 53%，respectively. Additives are useful for the growth of the bacteria strain. The combined application of herbicides and Ha1 granules could significantly improve the efficacy of herbicides or Ha1 granules applied separately.

Key words：Serratia marcescens;herbicidal activity;fresh weight inhibition rate;herbicide

微生物農(nóng)藥具有選擇性高、對(duì)生態(tài)環(huán)境安全且不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，已經(jīng)成為新農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)之一[1]。黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一種革蘭氏陰性菌，其在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生一種次生代謝產(chǎn)物——靈菌紅素[2]，該菌本身和其代謝產(chǎn)物都具有抗菌[3]、抗腫瘤和免疫抑制等活性[4]，在疾病治療和植物病蟲草害防治方面發(fā)揮了重要作用。黏質(zhì)沙雷氏菌FS14菌株中的賽拉菌素和塞拉利辛樣蛋白酶（SPB）對(duì)棉鈴蟲幼蟲具有毒殺作用[5];黏質(zhì)沙雷氏菌YD25菌株對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、小麥根腐病病菌（Bipolaris sorokiniana）、西瓜炭疽病病菌（Colletotrichum lagenarium）、辣椒炭疽病病菌（Colletotrichum capsici）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等均具有較好的抑制作用[6];此外，研究發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的代謝產(chǎn)物粗提物對(duì)馬唐具有一定的抑制作用[7]。

微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量起著關(guān)鍵性作用。微生物發(fā)酵條件主要包括培養(yǎng)基成分、溫度以及pH值等。培養(yǎng)基主要以糖類為碳源，以蛋白胨為氮源，供給微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)[8]。200 Gy的伽馬輻射和最佳培養(yǎng)溫度能夠使黏質(zhì)沙雷氏菌的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加1倍，從而有效提高其抗菌等生物活性[9]。

在微生物農(nóng)藥的開發(fā)過程中，人們?yōu)樵黾悠浞€(wěn)定性、貯藏期和貨架期，通常在加工過程中添加助劑制成微生物制劑。常用的微生物農(nóng)藥制劑的助劑大致分為2種，一種是供病原菌生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)劑;另一種是作為微生物農(nóng)藥制劑在田間使用時(shí)，抵擋不良環(huán)境條件的保護(hù)劑[10]。在微生物制劑研究中還須要考慮助劑與微生物農(nóng)藥的相容性，保證菌株活性不受影響[11]。珍珠巖-膨潤(rùn)土混合物和吸附了20%噴霧干燥微膠囊的礦物載體制劑能夠延長(zhǎng)微生物制劑的貯藏期和保持微生物活性[12]。

由于微生物農(nóng)藥自身存在的不足，人們也致力于開展提高微生物農(nóng)藥速效性和防效的研究工作[13]。微生物農(nóng)藥復(fù)配能顯著提高農(nóng)藥使用效率及其防治效果[14]。莊超等研究發(fā)現(xiàn)，齊整小核菌菌株SC64與禾長(zhǎng)蠕孢菌稗草?；虷GE配合使用，提高了其對(duì)雜草的整體防治效果，擴(kuò)大了單一微生物除草劑的殺草譜[15]。鄭楠等研究發(fā)現(xiàn)，新月彎胞霉菌B6的懸浮體系與氰氟草酯混合使用，對(duì)水稻田各類雜草均具有較好的防治效果[16]。

本研究采用微生物除草劑和化學(xué)除草劑復(fù)配的方法，用黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1顆粒劑和3種化學(xué)除草劑進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定其對(duì)馬唐（Digitaria sanguinalis）、稗草（Echinochloa crusgalli）和苘麻（Abutilon theophrasti Medicus）等的除草活性，旨在為黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1顆粒劑可以研發(fā)成為一種微生物除草劑提供可能，為今后解決雜草抗性問題和減少化學(xué)農(nóng)藥使用貢獻(xiàn)力量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存。

1.1.2 供試雜草 馬唐、稗草、苘麻，以上雜草種子均于2017年9月在河北省保定市南二環(huán)采集。

1.1.3 供試藥劑 蛋白胨，購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;酵母膏，購(gòu)自太陽生物科技有限公司;瓊脂，購(gòu)自南京松冠生物科技有限公司;氯化鈉、次氯酸鈉，均購(gòu)自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;高嶺土，購(gòu)自保定市東亞化輕有限公司;粗面粉，購(gòu)自保定市江城面粉廠;50%莠去津、50%撲草凈，均購(gòu)自山東濱農(nóng)科技有限公司;960 g/L精異丙甲草胺，購(gòu)自先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司。

1.1.4 供試儀器 DHG-9070A 鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHS-2C pH儀，購(gòu)自上海三信儀表廠;CP214 萬分之一電子天平，購(gòu)自福州華志科學(xué)儀器有限公司;KCB-80 濕法制粒機(jī)，購(gòu)自北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司;3WP-2000 行走式噴霧塔，購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所;MTN-2800 氮吹儀，購(gòu)自美國(guó)Organomation公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Ha1菌株培養(yǎng)基成分篩選及優(yōu)化 培養(yǎng)基碳源（氮源、無機(jī)鹽）的篩選：選用葡萄糖、淀粉、牛肉膏、蔗糖、酵母膏等5種碳源（硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、秸稈粉、尿素等5種氮源;氯化鈣、磷酸鉀、硝酸鉀、硫酸鎂等4種無機(jī)鹽），固定LB液體培養(yǎng)基中的其他成分，將添加不同碳源（氮源、無機(jī)鹽）的發(fā)酵液在20 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，通過比較Ha1菌株發(fā)酵后的菌體干質(zhì)量來選擇最優(yōu)碳源（氮源、無機(jī)鹽）。

培養(yǎng)基多成分正交試驗(yàn)：在優(yōu)化的碳源、氮源和無機(jī)鹽基礎(chǔ)上，固定其他成分的用量，采用3因素3水平，即L9（34）的正交試驗(yàn)，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，比較Ha1菌株發(fā)酵產(chǎn)生的菌體生物量干質(zhì)量來確定菌株培養(yǎng)最適的碳源（A）、氮源（B）和無機(jī)鹽（C），每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)，具體試驗(yàn)方案見表1。

1.2.2 Ha1菌株發(fā)酵條件優(yōu)化 以初始pH值、振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度為變量，進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)，將發(fā)酵液的初始pH值分別設(shè)為5、7、9; 轉(zhuǎn)速分別設(shè)為120、160、200 r/min;培養(yǎng)溫度分別設(shè)為20、25、30 ℃。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方法對(duì)影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵的初始pH值（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（C）進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表2、表3所示。通過Design Exper 10軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)方程，并對(duì)方程進(jìn)行擬合分析和方差分析。

1.2.3 菌株培養(yǎng) 取200 μL Ha1菌種，均勻涂布在LB培養(yǎng)基上，靜置5 min，待培養(yǎng)基表面干燥后放入20 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h。挑取單菌落，接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中作為種子液，20 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，得到菌懸液Ⅰ。然后將菌懸液Ⅰ按1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，20 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，得到菌懸液Ⅱ，測(cè)定菌懸液Ⅱ的菌體生物量。

取菌懸液Ⅱ，4 000 r/min、4 ℃離心15 min，去上清。用無菌水洗滌沉淀物，60 ℃氮吹至干燥。稱量菌體干質(zhì)量，以每100 mL菌懸液中的菌體干質(zhì)量（g）為菌體生物量的指標(biāo)。將該菌懸液梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、…、10-8，各吸取100 μL涂板，20 ℃培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)量，每個(gè)梯度重復(fù)3次。

1.2.4 有效活菌數(shù)的測(cè)定 采用稀釋涂布平板法計(jì)算1 g顆粒劑中的有效活菌數(shù)，稱取4 g顆粒劑，加入40 mL無菌水靜置20 min，然后振蕩至顆粒劑完全溶解。吸取1 mL完全溶解的菌懸液，加入9 mL無菌水制成母液。將母液按“1.2.3”節(jié)中所述梯度進(jìn)行連續(xù)稀釋，分別吸取100 μL 10-6、10-7、10-8這3個(gè)稀釋梯度的菌懸液，加入到預(yù)先倒好的固體培養(yǎng)基平板上，均勻涂布在培養(yǎng)基表面，每個(gè)濃度重復(fù)3次，有效活菌數(shù)計(jì)算公式：1 g顆粒劑樣品的活菌數(shù)（CFU/g）=同濃度3次重復(fù)的菌落數(shù)量平均值×10×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 顆粒劑的制備 將粗面粉和高嶺土置于171 ℃高溫干熱滅菌3 h。待其冷卻后，取400 g粗面粉、200 g高嶺土充分混勻，再向內(nèi)緩慢加入400 mL含1010 CFU/mL的黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵液制成生面團(tuán)。將生面團(tuán)放入濕法制粒機(jī)中，擠壓制造成顆粒劑，自然晾干后裝入自封袋中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 添加大豆油助劑對(duì)Ha1顆粒劑活菌數(shù)的影響 配制添加精制大豆油的Ha1顆粒劑：50 mL 精制大豆油，200 g粗面粉，100 g高嶺土，200 mL含1010 CFU/mL的Ha1菌株菌懸液，按照“1.2.5”節(jié)中顆粒劑制作方法進(jìn)行樣品制備，同時(shí)制備未添加精制大豆油的顆粒劑作對(duì)照，將制好的顆粒劑于4 ℃ 保存。連續(xù)9周測(cè)量顆粒劑內(nèi)的活菌數(shù)，取 1 g 顆粒劑溶解于9 mL MgSO4緩沖液中，充分振蕩15 min，吸取100 μL菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。每種樣品3次重復(fù)，取3次重復(fù)的平均值。

1.2.7 化學(xué)除草劑與Ha1菌株的相容性 化學(xué)除草劑對(duì)Ha1菌株生長(zhǎng)的影響：活化Ha1菌株，接種培養(yǎng)48 h制成種子液，然后按1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)72 h，制成菌懸液備用。將50%撲草凈（推薦用量為100 g/667 m2）、960 g/L精異丙甲草胺（推薦用量為 100 mL/667 m2）和50%莠去津（推薦用量為90 g/667 m2）按推薦用量與培養(yǎng)基混勻，在每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL帶藥培養(yǎng)基，制成帶藥培養(yǎng)基平板待用，設(shè)置不含藥的對(duì)照平板，每個(gè)處理3次重復(fù)。吸取1 mL發(fā)酵好的Ha1菌株菌懸液到 9 mL 無菌水試管中，進(jìn)行梯度稀釋，然后吸取 100 μL 不同濃度的Ha1菌株菌懸液，注入帶藥培養(yǎng)基平板中，均勻涂開，20 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察3種化學(xué)除草劑對(duì)各濃度Ha1菌株活菌數(shù)的影響，試驗(yàn)重復(fù)3次。

化學(xué)除草劑與Ha1菌株的相容性：活化Ha1菌株，接種培養(yǎng)，然后將50%撲草凈、960 g/L精異丙甲草胺和50%莠去津按照推薦用量與培養(yǎng)基混合。將發(fā)酵好的Ha1菌株菌懸液按1%的接種量接入帶藥培養(yǎng)基中，20 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)置不添加藥劑的培養(yǎng)基接種菌懸液作為對(duì)照，每48 h測(cè)定1次活菌數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Ha1顆粒劑與70%推薦劑量化學(xué)除草劑復(fù)配的除草活性測(cè)定 對(duì)馬唐、稗草和苘麻種子進(jìn)行催芽、備用。選擇口徑為7 cm、高為10 cm的小花盆播種，裝入適量的滅菌壤土，將Ha1顆粒劑按110 g/m2的添加量放入小花盆中，覆蓋一層滅菌壤土，挑選發(fā)芽一致的雜草種子，每盆播種10粒，覆上1 cm厚的壤土。雜草未出芽之前，用噴霧塔定量噴施苗前化學(xué)除草劑，試驗(yàn)中復(fù)配藥用量設(shè)計(jì)見表4，設(shè)置無顆粒填埋噴施清水的處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理后封膜保濕，定期觀察出芽情況，10 d后測(cè)量雜草地上部鮮重，計(jì)算雜草的鮮重抑制率。

鮮重抑制率=對(duì)照組鮮重-處理組鮮重對(duì)照組鮮重×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ha1菌株培養(yǎng)基成分篩選及優(yōu)化結(jié)果

培養(yǎng)基碳源、氮源和無機(jī)鹽的篩選：黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵后的菌體干質(zhì)量數(shù)據(jù)見表5至表7，當(dāng)培養(yǎng)基中添加的碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為蔗糖、蛋白胨、氯化鈣時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)的菌體干質(zhì)量分別為0.45、0.93、0.65 g/100 mL，菌體干質(zhì)量均達(dá)到不同培養(yǎng)條件的最大值。所以，黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵的最優(yōu)基碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為蔗糖、蛋白胨和氯化鈣。

培養(yǎng)基多成分正交試驗(yàn)：培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)鹽優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，蔗糖、蛋白胨和氯化鈣的添加量對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的生長(zhǎng)均能產(chǎn)生一定的影響，從極差的大小來看，各因子作用的順序表現(xiàn)為B（蛋白胨）>C（氯化鈣）>A（蔗糖），即蛋白胨用量對(duì)Ha1菌株的菌體干質(zhì)量值影響最大，氯化鈣次之，蔗糖的影響最小。以菌體干質(zhì)量作為指標(biāo)，最終選取在A2B3C1因素水平下進(jìn)行培養(yǎng)，即菌株培養(yǎng)的最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽分別為蔗糖、蛋白胨和氯化鈣，最適配比為蔗糖 10 g/L，蛋白胨20 g/L，氯化鈣1 mol/L。

2.2 Ha1菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

Ha1菌株二次回歸擬合及方差分析：利用Design Expert 10軟件對(duì)表9中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Ha1菌株發(fā)酵的初始pH值（A′）、培養(yǎng)溫度（B′）、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（C′）與Ha1菌體干質(zhì)量（R1）之間的回歸方程為 R1=-0.310A′2-0.110B′2-0110C′2-0.038A′B′+0.093A′C′+1.475×10-3B′C′-0.091A′+0020B′+0.086C′+1.530。

由表10可知，試驗(yàn)中的回歸模型達(dá)到顯著水平（P=0.001）時(shí)，二次擬合回歸方程的R2為0949 1，該模型能夠解釋有94.91%的變化，僅有總變異的5.09%不能用此模型來解釋。失擬項(xiàng)在P=0.05 水平上不顯著（P=0.092 3>0.05），說明回歸方程預(yù)測(cè)與實(shí)際結(jié)果擬合度較高，可用該回歸方程代替真實(shí)點(diǎn)對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。模擬一次項(xiàng)中對(duì)Ha1生長(zhǎng)量的影響表現(xiàn)為A′（初始pH值）>C′（轉(zhuǎn)速）>B′（培養(yǎng)溫度）;在模型二次項(xiàng)的回歸方程關(guān)系中，A′2為極顯著，B′2、C′2都為顯著，說明初始pH值、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)都有影響。在交互項(xiàng)分析中，A′B′、B′C′交互效應(yīng)不顯著，說明培養(yǎng)溫度與初始pH值、培養(yǎng)溫度與轉(zhuǎn)速之間的交互作用對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株生長(zhǎng)量影響較小，因此在一定范圍內(nèi)可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度與初始pH值、培養(yǎng)溫度與轉(zhuǎn)速的關(guān)系來提高Ha1菌株的生物量干質(zhì)量。

利用Design Expert 10軟件對(duì)表9中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后得到二次多項(xiàng)式回歸方程的響應(yīng)面圖形及等高圖形，如圖1至圖3所示。三維曲面圖能直觀地體現(xiàn)出各因素之間相互作用對(duì)響應(yīng)面的影響，發(fā)現(xiàn)Ha1菌株最佳響應(yīng)值（菌體干質(zhì)量）為1.55 g/100 mL。試驗(yàn)中各因素的取值：pH值為6.802，培養(yǎng)溫度為19.538 ℃，轉(zhuǎn)速為193738 r/min。因此，對(duì)Ha1菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的條件為初始pH值為7，培養(yǎng)溫度為20 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，并設(shè)4次重復(fù)試驗(yàn)，所得到的固體發(fā)酵產(chǎn)物中生物量的平均值為1.549 g/100 mL，說明Design Expert 10軟件對(duì)實(shí)際結(jié)果預(yù)測(cè)的較為準(zhǔn)確，采用響應(yīng)面法優(yōu)化Ha1菌株搖瓶發(fā)酵條件方法可行。

2.3 添加大豆油助劑對(duì)Ha1顆粒劑活菌數(shù)的影響

顆粒劑中添加大豆油與未添加大豆油對(duì)Ha1活菌數(shù)有一定的影響。由圖4可知，Ha1顆粒劑中的初始活菌數(shù)為2.5×1010 CFU/g，Ha1顆粒劑貯存9周后，添加大豆油的Ha1顆粒劑的活菌數(shù)為2.8×109 CFU/g，未添加大豆油的Ha1顆粒劑的活菌數(shù)為1.9×109 CFU/g，添加大豆油助劑比未添加大豆油助劑Ha1顆粒劑的活菌數(shù)多0.9×109 CFU/g。因此，添加大豆油助劑有利于Ha1菌株的貯存。

2.4 化學(xué)除草劑對(duì)Ha1菌株生長(zhǎng)的影響

將50%撲草凈、960 g/L精異丙甲草胺和50%莠去津按推薦用量分別添加到培養(yǎng)基中制成帶藥平板，研究不同除草劑對(duì)Ha1菌株生長(zhǎng)的影響。由圖5可知，在含有50%撲草凈、960 g/L精異丙甲草胺和50%莠去津的平板中，Ha1菌株均能正常生長(zhǎng)，活菌數(shù)與對(duì)照相比無明顯差異，各處理與空白對(duì)照（CK）的單菌落生長(zhǎng)勢(shì)也基本相同。在含有50%撲草凈、960 g/L精異丙甲草胺和50%莠去津的平板上生長(zhǎng)的菌落與對(duì)照相比，活菌數(shù)分別多出0.25×108、0.30×108、0.80×108 CFU/mL（圖6）。由此表明，50%撲草凈、960 g/L 精異丙甲草胺和50%莠去津均不影響Ha1菌株的正常生長(zhǎng)，可以復(fù)配使用。

2.5 化學(xué)除草劑與Ha1菌株的相容性

由圖7可知，50%撲草凈、960 g/L精異丙甲草胺和50%莠去津與Ha1菌株的相容性均較好。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這3種化學(xué)除草劑對(duì)菌株的生長(zhǎng)均無明顯影響，且在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的活菌數(shù)整體高于對(duì)照，其中50%莠去津在144、168、192 h培養(yǎng)時(shí)間下活菌數(shù)明顯高于對(duì)照。

2.6 Ha1顆粒劑與70%推薦劑量的化學(xué)除草劑復(fù)配的除草活性

施藥7 d后，馬唐、稗草和苘麻均表現(xiàn)出生長(zhǎng)減緩、發(fā)芽率降低、植株弱小、倒伏等的生長(zhǎng)情況。由圖8可知，單獨(dú)使用70%推薦劑量的撲草凈、精異丙甲草胺和莠去津時(shí)，對(duì)馬唐的鮮重抑制率分別為67.47%、66.59%、78.27%，對(duì)稗草的鮮重抑制率分別為73.64%、80.00%、78.35%，對(duì)苘麻的鮮重抑制率分別為43.50%、37.50%、7449%。單獨(dú)使用Ha1顆粒劑時(shí)，對(duì)馬唐、稗草和苘麻的鮮重抑制率分別為59.42%、58.01%、40.47%。70%推薦劑量的撲草凈、精異丙甲草胺、莠去津與Ha1顆粒劑復(fù)配時(shí)，對(duì)馬唐鮮重的抑制率分別為97.61%、94.47%、96.35%，對(duì)稗草的鮮重抑制率分別為85.68%、86.50%、8981%，對(duì)苘麻的鮮重抑制率分別為53.03%、79.53%、86.92%。70%推薦劑量的化學(xué)除草劑與Ha1顆粒劑復(fù)配使用，對(duì)馬唐、稗草和苘麻的防除效果明顯高于單獨(dú)使用除草劑或者Ha1顆粒劑的防除效果。

3 結(jié)論與討論

進(jìn)行微生物發(fā)酵工藝的優(yōu)化，能在很大程度上提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，降低生產(chǎn)成本。王瑞龍等優(yōu)化了鏈霉菌（Streptomyces sp.）6803菌株的發(fā)酵工藝，顯著提高了其菌絲產(chǎn)量和除草活性[17]。朱海霞等采用單因素分析法和正交試驗(yàn)篩選得到層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）GD-5菌株的最適培養(yǎng)條件，提高了菌株的除草活性[18]。本試驗(yàn)篩選了黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的發(fā)酵條件，不僅簡(jiǎn)化了試驗(yàn)過程，還明確了各因素之間的交互影響，為提高黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的生長(zhǎng)量及其除草活性奠定了基礎(chǔ)。

現(xiàn)階段微生物農(nóng)藥還無法代替化學(xué)農(nóng)藥，廣大學(xué)者紛紛從微生物農(nóng)藥復(fù)配方面展開研究，以期通過微生物菌株混合使用或微生物菌株與減量的化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配使用，來達(dá)到提高微生物農(nóng)藥廣譜性和協(xié)同增效，減少化學(xué)農(nóng)藥用量的目的[19]。生防菌株NJ13分別與50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑（WG）、10%苯醚甲環(huán)唑WG復(fù)配對(duì)人參黑斑病的聯(lián)合毒力和田間防效具有增效作用[20]。新型殺菌劑氟吡胺與生防菌甲基芽孢桿菌TA-1聯(lián)合施用對(duì)番茄灰霉病具有協(xié)同增效作用[21]。微生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配之所以能夠提高防治效果，可能是因?yàn)槲⑸锞昀昧嘶瘜W(xué)農(nóng)藥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或者是化學(xué)農(nóng)藥中的成分增強(qiáng)了菌株活性，從而促進(jìn)菌株生長(zhǎng)或產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物來防除病蟲草。在微生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配使用時(shí)，兩者的相容性也是非常重要的。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）SV2與替美福司（雙硫磷）協(xié)同作用相容性較好且降低了單個(gè)農(nóng)藥使用的半數(shù)致死量（LD50）[22]。Ha1顆粒劑如同大多數(shù)微生物除草劑一樣，相比化學(xué)除草劑的除草效果相對(duì)較低，對(duì)雜草嚴(yán)重發(fā)生情況或者惡性難除雜草的防治效果不理想，所以筆者所在課題組考慮將其與化學(xué)除草劑復(fù)配從而提高其自身除草效果。本試驗(yàn)采用撲草凈、精異丙甲草胺、莠去津與Ha1菌株復(fù)配，相容性均較好，除草活性也相比單一使用化學(xué)除草劑或Ha1顆粒劑高。

選擇菌藥復(fù)配的目的是提高單個(gè)農(nóng)藥的廣譜性，不同化學(xué)農(nóng)藥與微生物農(nóng)藥復(fù)配的防治效果不同[23]，相同化學(xué)農(nóng)藥不同濃度與微生物農(nóng)藥復(fù)配的防治效果也存在一定差異。一般情況下，高濃度化學(xué)農(nóng)藥對(duì)有害生物具有較高的防除效果，但是高濃度的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)微生物也有一定的毒害作用，因此篩選適宜復(fù)配的化學(xué)農(nóng)藥濃度與種類是微生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。本試驗(yàn)用撲草凈、精異丙甲草胺、莠去津與Ha1顆粒劑復(fù)配提高了單一使用化學(xué)除草劑或Ha1顆粒劑的除草活性，但還須篩選化學(xué)除草劑不同減量處理與Ha1顆粒劑復(fù)配的除草效果，盡可能地減少化學(xué)除草劑的用量。

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