(浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023)

竹子屬于禾本科竹亞科常綠植物,中國是竹資源大國,竹林種植面積達到500萬公頃,世界上排名第一[1]。竹葉作為竹材的副產(chǎn)品,長期未得到有效的利用,隨著社會的發(fā)展人們對生物質(zhì)資源越來越重視,竹葉的開發(fā)利用成為熱點。竹葉中含有大量的纖維素和半纖維素,理論上可以制備單糖、葡聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖等多糖或低聚糖。多糖是一類廣泛存在于動物、植物及微生物等有機體中的大分子化合物,聚合度一般大于10[1],在自然界中儲量十分豐富,主要分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[2-3]。大量研究表明多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降血糖、調(diào)節(jié)機體免疫功能和抑菌等生理活性[4-8]。中醫(yī)理論認為竹葉味甘、性寒,具有利尿、清心除煩的功效,大量研究表明竹葉多糖是一種大分子雜多糖且具有抗癌功能,能增強機體的免疫能力,有抗氧化、降低血糖和抑菌等多種生理功能[9-12]。因此,竹葉多糖作為天然產(chǎn)物,其毒副作用非常小,其發(fā)展應用前景較廣闊。

目前,關于竹葉多糖的研究主要圍繞在提取工藝的優(yōu)化,但對竹葉多糖的生物活性研究較少。竹葉多糖傳統(tǒng)的提取方法有超聲波提取法[13-14]、酶提取法[15]、水浸提法[16]等提取方法,這些傳統(tǒng)的提取方法具有原料消耗大、提取時間長、得率低、工業(yè)化生產(chǎn)難度高等缺點。傳統(tǒng)的提取方法不能從竹葉中提取出大量的多糖,因此,將多種方法協(xié)同起來提取竹葉多糖成為一種趨勢。同時,竹葉多糖生物活性研究主要圍繞在抗氧化、抑菌等基礎的生物活性,關于抗腫瘤方面的研究較少。

本文以一年生毛竹竹葉為主要試材,通過超聲固體雜多酸技術提取毛竹竹葉多糖,提高竹葉多糖的得率,并對其結構與組成進行初步鑒定,將獲得的竹葉多糖進行體外抗氧化活性和抗腫瘤活性研究,其主要目的是提高竹資源利用效率,為竹產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級助力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一年生新鮮毛竹竹葉1 kg 3月份自摘于浙江科技學院后山;鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸 分析標準品,阿拉丁;半乳糖醛酸分析標準品 北京索萊寶科技有限公司;磷鎢酸、氫氧化鈉、乙酸鈉 分析純,美國賽默飛世爾科技公司;濃硫酸、苯酚、無水乙醇 分析純,上海凌峰化學試劑有限公司;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 碧云天生物技術;基礎培養(yǎng)基(MEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗 武漢譜諾賽生命科技有限公司。

ICS-5000+離子色譜儀、電化學檢測器(Au為工作電極,Ag/AgCl為參比電極)、Heraeus Multifuge X1R離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱、MSC-AdvantageTMII 級生物安全柜 美國賽默飛世爾科技公司;UNIQUE-LC多功能超純水系統(tǒng) 瑞斯捷;BSA124S分析天平 德國賽多利斯;DHG-9013A烘箱 上海一恒科學儀器有限公司;超聲波反應釜 上海霍桐實驗儀器有限公司;SpectraMax iD3多功能酶標儀 美谷分子儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克儀器公司;EM-1011透射電鏡 日本電子公司;倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將新鮮采摘的毛竹竹葉除雜、純水清洗、烘干至恒重、粉碎,加入3倍體積的95%乙醇抽提,重復3～4次,60 ℃烘干至恒重,使用水分測定儀測其含水率,烘干密封,備用。

1.2.2 竹葉多糖提取及含量測定 稱取竹葉粉加入到100 mL的超聲波反應釜中,加入一定量的水和一定質(zhì)量分數(shù)的磷鎢酸,在反應器中按照一定的超聲功率和一定的超聲溫度反應一定的時間,布氏漏斗抽濾,除去殘渣,加入最終濃度為80%的無水乙醇,4 ℃靜至12 h,8000 r/min下離心獲得竹葉多糖沉淀。分別經(jīng)過Sevage法除去蛋白質(zhì)、真空冷凍干燥,最終得到竹葉多糖。

采用苯酚-硫酸法檢測樣品中多糖含量[17-18],以葡萄糖為標準品,以多糖的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,吸光度(y)為縱坐標,得到標準曲線y=0.007x-0.0047,線性范圍為20.00～120.00 μg/mL,相關系數(shù)R2為0.9999。吸取25 μL多糖溶液,根據(jù)標準曲線計算多糖濃度,按照式(1)計算多糖含量。

式(1)

式中:c為樣液中多糖濃度(μg/mL);V為樣液體積(m/L);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實驗 以竹葉多糖的得率為考察指標。分別考察超聲波功率、磷鎢酸的質(zhì)量濃度、超聲溫度、超聲時間以及料液比對多糖得率的影響。

1.2.3.1 超聲功率對竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%,超聲溫度為80 ℃,超聲時間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察超聲功率60、120、180、240、300 W對竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.2 磷鎢酸質(zhì)量濃度對竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,超聲溫度為80 ℃,超聲時間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察磷鎢酸質(zhì)量濃度0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%對竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.3 超聲溫度對竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲時間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察超聲溫度60、70、80、90、100 ℃對竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取時間對竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲溫度為80 ℃,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察提取時間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h對竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.5 料液比對竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲溫度為80 ℃,提取時間為2 h下,分別考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL對竹葉多糖得率的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理,以料液比(A)、反應溫度(B)和提取時間(C)這3個因素為自變量進行組合優(yōu)化,以多糖得率(Y)為響應值,進行響應面分析。試驗設計與水平見表1。

表1 響應面實驗的因素及水平Table 1 Levels and factors of response surface experiment

1.2.5 竹葉多糖結構分析

1.2.5.1 紅外光譜分析 準確稱取1.0 mg干燥的竹葉多糖與 KBr 粉末于研缽中研磨混合均勻,壓成薄片,在波4000～400 cm-1范圍內(nèi)利用紅外光譜儀進行光譜掃描[19-22],分辨率為0.09 cm-1。

1.2.5.2 多糖物理形貌分析 采用電子掃描顯微鏡(SEM)將反應前后的原料及竹葉多糖放大5.5×103倍進行表征。表征前需對樣品進行噴金處理,電鏡工作電壓為10 kV。

1.2.5.3 竹葉多糖單糖組成分析 準確稱取適量竹葉多糖,加入適量的2 mol/L三氟乙酸(TFA),在110 ℃下封管2 h。將水解液低于40 ℃條件下減壓蒸干,加入3 mL甲醇蒸干,重復4～5次,以完全除去TFA[23-25]。用超純水定容到5 mL容量瓶中,采用高效陰離子色譜法檢測多糖水解液中單糖組成。

色譜條件:ICS-5000+高效陰離子色譜儀(HPAEC)、CarboPACTMPA10(4.0 mm×250 mm)陰離子交換柱(帶保護柱)、四電位波形。流速為0.80 mL/min;柱溫為20 ℃;進樣體積為25 μL,流動相為氫氧化鈉和乙酸鈉。竹葉多糖水解液梯度淋洗程序:0～30 min:2.5% 200 mmol/L NaOH和5% 200 mmo/L CH3COONa混合洗脫;30.1～53 min:50% 200 mmol/L NaOH和50% 200 mmol/L CH3COONa混合洗脫;53.1～56 min:100% 200 mmol/L NaOH洗脫;56.1～60 min:100% 200 mmol/L NaOH洗脫。

1.2.6 竹葉多糖體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的測定 用無水甲醇將DPPH試劑配制成1×10-4mol/L的溶液。準確吸取不同質(zhì)量濃度(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL)竹葉多糖待測樣液各2 mL,分別加入DPPH溶液4 mL,混合均勻,在25 ℃恒溫水浴下,放置30 min,于517 nm波長處測定吸光度[26-27]。以去離子水作為參比溶液、相同濃度的VC溶液作為陽性對照,按照式(2)計算DPPH自由基清除率。

式(2)

式中:A0為去離子水+DPPH-甲醇溶液吸光度;A1為樣品+DPPH-甲醇溶液吸光度;A2為樣品+甲醇溶液吸光度。

1.2.6.2 還原力的測定 將1 mL不同質(zhì)量濃度的竹葉多糖溶液(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mg/mL)分別與2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液以及2.5 mL 1%的鐵氰化鉀(w/v)混合,于50 ℃恒溫水浴中反應30 min,然后加入2.5 mL 10%的三氟乙酸和0.5 mL 0.1%三氯化鐵(w/v)終止反應,離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵(w/v),混合均勻,在700 nm下測定吸光度[28-29]。以去離子水為參比溶液,以相同濃度的VC溶液作為陽性對照。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除能力 取7.00 mmol/L ABTS+和5.00 mmol/L過硫酸鉀等體積混合,在室溫下黑暗放置12～16 h,得到ABTS+儲備液,用PBS緩沖溶液將儲備液稀釋,使其在734 nm波長下吸光度值在0.7±0.02之間,備用。取不同質(zhì)量濃度的竹葉多糖溶液(0.30、0.50、0.70、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL)300 μL,分別加入5 mL上述稀釋液,在30 ℃條件下,反應1 h,在734 nm波長下測定吸光度[30-31]。以去離子水作為參比溶液,相同濃度的VC溶液最為陽性對照。按照式(3)計算ABTS自由基清除率。

式(3)

式中:A0為去離子水+ABTS+自由基PBS溶液吸光度;A1為樣品+ABTS+自由基PBS溶液吸光度;A2為樣品+PBS溶液吸光度。

圖1 不同因素對竹葉組多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different factors on the extraction rate of bamboo leaves polysaccharides

1.2.7 竹葉多糖體外抑制腫瘤細胞增殖實驗 采用MTT法進行測定。人肝癌細胞HepG-2生長于EMEM基礎培養(yǎng)基中,在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)并傳代。將處于對數(shù)期的HepG-2細胞用胰蛋白酶消化后加入新鮮的EMEM基礎培養(yǎng)基配置成濃度為1×105cell/mL,每孔100 μL加入到96孔板內(nèi)。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁后。培養(yǎng)液中加入不同濃度的多糖(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL)100 μL各組分繼續(xù)孵育48 h。陰性對照由未經(jīng)處理的細胞設定。培養(yǎng)結束后,用顯微鏡對各組的細胞進行觀察,棄上清液,每孔加入100 μL PBS清洗一次,每個孔中添加10 μL 新鮮配制的MTT(5.00 mg/mL)和100 μL新鮮的EMEM基礎培養(yǎng)基。經(jīng)過4 h的培養(yǎng)后,用Formazan(100 μL)溶解形成的晶體,恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖勻。用酶標儀在波長570 nm處測定吸光度,按照式4計算竹葉多糖的腫瘤細胞抑制率。

式(4)

式中:A0為空白對照孔的吸光度;A1為樣品孔的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次,響應面優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次回歸分析及方差分析,其余實驗結果均采用Origin 9.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 竹葉多糖提取單因素實驗結果

竹葉多糖提取過程中磷鎢酸質(zhì)量分數(shù)、超聲溫度、超聲功率、提取時間、料液比對提取竹葉多糖效果的影響見圖1。

由圖1a可知,隨著磷鎢酸質(zhì)量分數(shù)的增加,竹葉多糖得率逐漸上升,這是由于磷鎢酸破壞了竹葉細胞壁結構,促進了竹葉多糖的浸出。當磷鎢酸質(zhì)量濃度在0.5%～4.5%范圍內(nèi)時,竹葉多糖得率隨著磷鎢酸質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,當磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%時,竹葉多糖得率最高,考慮到成本問題如果進一步增加磷鎢酸質(zhì)量濃度,將會提高成本。因此,選擇磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%作為最佳反應濃度。

如圖1b,隨著提取溫度的上升,竹葉多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,隨著溫度的上升促進了分子運動,加快了多糖的浸出;但是隨著溫度的進一步上升,促進了多糖的降解。因此,選擇80 ℃作為最佳反應溫度。

圖1c表明,隨著超聲功率的提高,竹葉多糖得率呈上升趨勢,由于超聲波產(chǎn)生的空化作用,促進了多糖的浸出。由于儀器原因,最大功率只能達到300 W,因此,選擇超聲波功率300 W為最佳反應功率。

由圖1d可知,隨著提取時間的增加,竹葉多糖的得率逐漸上升,在2 h時達到最大值。2 h后,竹葉多糖得率呈現(xiàn)相對平穩(wěn)的狀態(tài),因此,選擇最佳反應時間為2 h。

圖1e表明,隨著料液比的增加,竹葉多糖的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當料液比為1∶20 g/mL時,竹葉多糖得率最大,因此,選擇最佳料液比為1∶20 g/mL。

2.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析 響應面實驗結果見表2,利用Design-Expert 8.0軟件,建立料液比、提取溫度及提取時間三因數(shù)數(shù)學回歸模型為:

Y=9.64+0.89A+0.61B+0.12C-1.25AB-0.28AC-0.65BC-1.51A2-1.31B2-0.56C2。

表2 響應面設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

注：*差異顯著(P<0.05);**差異高度顯著(P<0.01);***差異極顯著(P<0.001)。

2.2.2 響應面試驗結果及方差分析 由圖2可以直觀的看出料液比、提取溫度和反應時間對竹葉多糖的提取的影響及各因素之間交互作用的顯著程度。通過響應面曲面的坡度可以直接反映了因素發(fā)生變化時竹葉多糖得率的響應靈敏度,等高線圖為橢圓形時說明兩因素交互作用顯著。由圖2a1、圖2b1、圖2c1可知,料液比對多竹葉多糖的得率影響最為顯著,料液比和反應溫度對竹葉多糖的得率有較大的影響。由圖2a2、圖2b2、圖2c2可知,料液比和提取溫度以及超聲溫度和提取時間交互作用對竹葉多糖的得率影響顯著。通過回歸模型的分析,以竹葉多糖得率為評價指標,竹葉多糖適宜的提取工藝參數(shù)為超聲功率300 W,磷鎢酸質(zhì)量分數(shù)4.50%,提取時間1.99 h、超聲溫度80.61 ℃、料液比1∶21.22 g/mL。在此條件下,模型預測竹葉多糖提取率為9.78%?？紤]到實際應用過程中操作簡單,將最佳工藝參數(shù)修正為超聲功率300 W,磷鎢酸質(zhì)量分數(shù)4.50%,提取時間2 h、超聲溫度80 ℃、液料比1∶20 g/mL;在此條件下,竹葉多糖的提取率為9.89%,實際值與理論值基本相符,說明模型對竹葉多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行,具有一定的實用價值。

2.3 竹葉多糖結構表征

2.3.1 紅外光譜分析 由圖3可知,竹葉水溶性多糖在3413 cm-1有較強且較寬的吸收峰為O-H伸縮振動,位2924 cm-1附近的吸收峰為CH3或CH2的C-H收縮振動峰[32]。位于1635 cm-1附近的吸收峰是羧基的C=O非對稱伸縮振動[33]。位于1462 cm-1附近的吸收峰為C-H的變角振動,位于1000～1300 cm-1附近的吸收峰為吡喃環(huán)的醚鍵(C-O-C)和羥基(C-O-H)的伸縮振動[34]。位于894 cm-1附近的吸收峰說明多糖含有β-糖苷鍵,位于817 cm-1附近的吸收峰為α-型吡喃糖的C-H彎曲振動[35]。綜上所述,以上吸收峰的存在說明提取物具有多糖化合物的特征吸收峰。

圖3 竹葉多糖的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of bamboo leaves polysaccharides

圖2 各因數(shù)對竹葉多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface map and contour map of the effect of various factors on the yield of bamboo leaves polysaccharides

圖4 竹葉粉末和竹葉多糖SEM圖(×5500)Fig.4 SEM images of bamboo leaf powder and polysaccharides(×5500)注:a:未處理的竹葉粉;b:提取后的竹葉粉;c:竹葉多糖;紅色箭頭標注:提取前后竹葉的微觀變化。

2.3.2 竹葉多糖表面形貌分析 由圖4a竹葉原料反應前的掃描電鏡圖觀察到,未經(jīng)處理的竹葉粉末表面形貌光滑、組織呈現(xiàn)出完整的塊狀、有少量的小碎片且形狀不規(guī)則。由圖4b超聲波耦合磷鎢酸提取后竹葉粉末掃描電鏡圖觀察到,在超聲波和磷鎢酸共同作用后,竹葉粉末凹凸不平,帶有孔洞的褶皺結構,從而將竹葉粉末的內(nèi)容物釋放出來,提高了竹葉多糖的提取率。圖4c為竹葉多糖的掃描電鏡圖,通過對竹葉多糖的形貌特征的觀察,多糖表面呈現(xiàn)塊狀和蜂窩狀結構,表面結合較為緊密,呈現(xiàn)蜂窩狀的原因可能是因為多糖分子鏈間形成細微的多孔結構,且蜂窩狀表面較緊密、平整,表明多糖分子存在聚集體。

2.3.3 竹葉多糖單糖組成分析 將竹葉多糖水解得到的單糖與9種混合標準單糖的高效陰離子色譜圖進行比對(圖5和圖6)可知,竹葉多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖組成,根據(jù)其峰面積計算6種單糖的摩爾比為0.32∶0.12∶1.75∶1.89∶1.22∶15.13。

圖5 9種混合標準單糖衍生物的HPAEC圖Fig.5 HPAEC for derivatives of9 standard monosaccharide mixture注:1:巖藻糖;2:鼠李糖;3:阿拉伯糖;4:半乳糖;5:葡萄糖;6:木糖;7:果糖;8:半乳糖醛酸;9:葡萄糖醛酸;圖6同。

圖6 竹葉多糖衍生物的HPAEC圖Fig.6 HPAEC of derivatives ofbamboo leaves polysaccharide

2.4 竹葉多糖抗氧化活性能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖7可知,隨著竹葉多糖質(zhì)量濃度逐漸增加,其對DPPH自由基的清除率逐漸增大,當竹葉多糖質(zhì)量濃度達到4.00 mg/mL時DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定,其清除能力達到85.91%。在所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),竹葉多糖的DPPH自由基清除能力均明顯低于相同質(zhì)量濃度的VC。竹葉多糖與賈金霞等[36]研究的銅綠菇多糖抗氧化活性相比較,當多糖濃度達到4 mg/mL時,竹葉多糖DPPH自由基清除率為85.91%,銅綠菇多糖DPPH自由基清除率為38.97%,表明竹葉多糖可作為抗氧化劑良好來源。

圖7 竹葉多糖DPPH自由基清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH freeradical of bamboo leaves polysaccharides

2.4.2 還原能力 竹葉多糖分子中含有醛基和羰基,可以通過自身的還原作用,清除自由基,還原能力越強,其抗氧化能力越強[37]。由圖8可知,隨著竹葉多糖的質(zhì)量濃度逐漸增加,其還原力緩慢上升,當竹葉多糖質(zhì)量濃度為7.00 mg/mL時,其還原力為0.569。在所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),竹葉多糖的還原力明顯低于相同質(zhì)量濃度的VC。與教小磐等[38]的甜茶葉多糖的還原力比較發(fā)現(xiàn),竹葉多糖的還原能力優(yōu)于甜茶葉多糖。

圖8 竹葉多糖還原力Fig.8 Reducing power of bamboo leaves polysaccharides

2.4.3 ABTS+自由基清除能力 ABTS+被過硫酸鉀氧化形成藍綠色的穩(wěn)定的ABTS+自由基,ABTS+自由基與抗氧化劑結合使之褪色,在734 nm波長下,測定其吸光度,比較樣品抗氧化能力。由圖9可知,隨著竹葉多糖的質(zhì)量濃度逐漸增加,其對ABTS+自由基清除率逐漸增大,當竹葉多糖質(zhì)量濃度達到2.00 mg/mL后ABTS+自由基清除率趨于穩(wěn)定,其清除率達99.23%。與許海棠等[39]研究的山豆根多糖比較發(fā)現(xiàn),竹葉多糖和山豆根多糖在ABTS+自由基清除能力相當。表明竹葉多糖可作為抗氧化劑良好來源。

圖9 竹葉多糖ABTS+自由基清除率Fig.9 Scavenging rate of ABTS+ freeradical of bamboo leaves polysaccharides

2.5 竹葉多糖對腫瘤細胞增殖抑制作用

圖10 竹葉多糖對HepG2細胞體外增殖的影響Fig.10 Effect of bamboo leaf polysaccharide on thegrowth of HepG-2 cells in vitro

活細胞中的線粒體含有琥珀酸脫氫酶,它可以與MTT黃色溶液形成不可溶的藍紫色甲瓚結晶,并沉積在細胞中;死細胞中不存在琥珀酸脫氫酶,不會出現(xiàn)紫色甲瓚結晶。根據(jù)此原理,測試了竹葉多糖對肝癌HepG-2細胞的抑制效果。由圖10可知,竹葉多糖對HepG-2細胞的增殖顯示出了較強的抑制作用,隨著竹葉多糖質(zhì)量濃度的增加,其對HepG-2細胞的增殖抑制率逐漸提高,說明抑制率與竹葉多糖的質(zhì)量濃度有關。當竹葉多糖的質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時,對HepG-2細胞的增殖抑制率達到半抑制濃度，抑制率為53.18%。綜上可知,竹葉多糖具有一定的抗腫瘤活性。

由圖11a觀察到細胞貼壁生長,細胞之間緊密連接,細胞壁光滑,折光性好。由圖11b～圖11d經(jīng)過竹葉多糖處理的細胞,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,細胞的結構和形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。由圖11d觀察到經(jīng)過4.00 mg/mL的竹葉多糖處理的細胞,細胞核發(fā)生明顯改變,部分細胞出現(xiàn)貼壁細胞數(shù)量減少、懸浮和凋亡小泡等明顯的凋亡特征。

圖11 竹葉多糖誘導HepG-2細胞凋亡的形態(tài)學觀察Fig.11 Cell morphology of Hep G2 cells treatedwith bamboo leaf polysaccharides注:a:未處理正常細胞;b:0.25 mg/mL竹葉多糖處理的細胞;c:1.00 mg/mL竹葉多糖處理的細胞;d:4.00 mg/mL竹葉多糖處理的細胞;紅色標記-死亡、凋亡的非正常細胞。

3 結論與討論

研究利用超聲波輔助雜多酸水解法對竹葉多糖進行提取,通過單因素和響應面試驗對提取工藝進行優(yōu)化,確定最佳工藝參數(shù)為:提取竹葉多糖最優(yōu)條件為:超聲溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶20 g/mL、磷鎢酸質(zhì)量分數(shù)4.50%、超聲功率300 W。此條件下,竹葉多糖的提取率為9.89%。與回歸方程的預測值相近,具有一定的實用價值。采用高效陰離子色譜和傅里葉紅外色譜對竹葉多糖結構進行了初步表征,為竹葉多糖結構的進一步研究和多糖的高值化利用提供實驗依據(jù)。竹葉多糖對ABTS+和DPPH自由基有較好的清除能力,且與多糖的質(zhì)量濃度成正相關,對ABTS自由基清除率在2.00 mg/mL接近100%,對DPPH自由基清除率在4.00 mg/mL達85.91%,具有良好的自由基清除能力。竹葉多糖質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時對癌細胞HepG-2增殖的抑制率可達到半抑制濃度,說明竹葉多糖具有一定的抗腫瘤活性。