李彥坡，鄒盈，李群和，王羅其，鄭曉杰*

溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（溫州 325006）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja）又名搖錢樹，是我國特有的珍稀植物，廣泛分布于浙江、江西、湖南、湖北等海拔為400～1 800 m的濕潤山地常綠林中。青錢柳葉味甘甜，具有清熱消腫、止痛等功效，多項(xiàng)研究表明，青錢柳葉具有降血糖、降血壓、降血脂等生物活性，被民間稱為“降糖神茶”[1-3]。青錢柳多糖被認(rèn)為是青錢柳葉中主要有效成分之一，已報(bào)道的文獻(xiàn)中，青錢柳多糖提取主要為水提法[4-6]、微波法[7]與超聲波輔助提取法[8-9]，采用超聲波、微波、酶等方法輔助提取，可縮短提取時(shí)間，提高產(chǎn)品得率。常規(guī)提取方法易破壞有效成分的生物活性，提取時(shí)間長，而采用低溫浸泡則溶媒用量大、耗時(shí)長、回收成本高[10]。超高壓提取技術(shù)在有效成分提取方面具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如提取率高、耗時(shí)、耗能少，產(chǎn)物活性高，并且在密閉環(huán)境下進(jìn)行，沒有溶劑揮發(fā)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，符合綠色環(huán)保要求，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)基本無影響。相對(duì)于傳統(tǒng)熱水提取，超高壓提取可明顯提高多糖的提取率，可較大程度保留多糖活性[11-13]。超高壓提取青錢柳多糖的報(bào)道較少[14]，對(duì)于超高壓提取工藝及其對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和活性的影響仍鮮見報(bào)道。試驗(yàn)應(yīng)用超高壓提取青錢柳葉多糖，獲得其最優(yōu)工藝，并測(cè)定青錢柳粗多糖抗氧化活性，以期為青錢柳多糖提取研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

青錢柳干葉（文成縣圣山食品開發(fā)有限公司）。

1.1.2 試劑

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；葡萄糖、石油醚、無水乙醇、苯酚、純硫酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸（均為國產(chǎn)分析純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

YB-600A型高速多功能粉碎機(jī)（永康速鋒工貿(mào)有限公司）；5 L型超高壓設(shè)備（溫州濱一機(jī)械廠）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；TGL-16M離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 青錢柳多糖超高壓提取工藝

干燥的青錢柳葉粉碎，過40目篩。按料液比1︰10（g/mL）的比例加入石油醚（沸程60～90 ℃），回流1 h脫脂，脫脂后過濾，濾渣烘干進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按料液比1︰3（g/mL）加入無水乙醇，在80 ℃水浴中加熱回流，以除去小分子醇溶物，過濾，所得濾渣干燥備用。將脫脂脫醇溶物后青錢柳粉末按一定料液比裝入聚乙烯復(fù)合袋中，排除空氣密封，置入超高壓裝置中進(jìn)行超高壓處理，卸壓后過濾，加入3倍體積無水乙醇，以8 000 r/min離心10 min后取上清液，測(cè)定青錢柳多糖含量[15-16]。

1.2.2 超高壓提取青錢柳多糖單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以青錢柳多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行超高壓提取青錢柳多糖單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)超高壓提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取效果影響顯著的因素進(jìn)行多因素正交試驗(yàn)，獲得超高壓提取青錢柳多糖最佳工藝參數(shù)。

1) 不同料液比對(duì)超高壓提取多糖得率的影響

設(shè)置超高壓提取溫度25 ℃，提取時(shí)間30 min，壓力300 MPa，料液比分別為1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30（g/mL）提取青錢柳多糖，提取后過濾，對(duì)濾液進(jìn)行多糖含量測(cè)定，研究提取料液比對(duì)多糖提取得率的影響。

2) 不同超高壓處理提取時(shí)間對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響

將樣品于超高壓處理溫度25 ℃，壓力300 MPa，料液比1︰20（g/mL）條件下，分別提取30，45，60，90和120 min，處理完成后過濾，測(cè)定濾液中多糖含量，研究不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響。

3) 不同提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定超高壓提取壓力300 MPa，料液比1︰20（g/mL），提取時(shí)間60 min，分別在20，30，40，50和60℃溫度下進(jìn)行提取，提取完成后過濾樣品，測(cè)定濾液中青錢柳多糖含量，研究不同提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響。

4) 不同超高壓處理壓力對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定超高壓提取青錢柳多糖的料液比1︰20（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取溫度40 ℃，分別在200，300，400，500和600 MPa壓力下進(jìn)行提取，提取完成后過濾樣品并多糖含量，研究不同提取壓力對(duì)多糖提取得率的影響。

5) 正交試驗(yàn)優(yōu)化超高壓提取工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取料液比、溫度及超高壓壓力為因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以獲得超高壓提取青錢柳多糖最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 青錢柳多糖的測(cè)定

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取10 mL，用蒸餾水稀釋定容至100 mL，即得100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取9支干凈具塞試管按表2方法操作，先在冰水浴中加入0.5 mL的90%，6%苯酚溶液，搖勻后緩慢加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞，在沸水中放置20 min，取出涼水冷卻10 min，0號(hào)為空白，在最大吸收波長處（490 nm）測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)（μg/mL），吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）[17]。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制加樣表

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2) 多糖含量測(cè)定

預(yù)處理后的青錢柳葉經(jīng)超高壓提取、過濾后定容到200 mL，取2 mL定容后的溶液加入6 mL無水乙醇，以8 000 r/min離心15 min。取沉淀用蒸餾水溶解定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取該溶液0.5 mL進(jìn)行顯色，在490 nm下測(cè)定其吸光度，根據(jù)所得回歸曲線方程計(jì)算多糖得率。

1.2.4 青錢柳多糖抗氧化活性測(cè)定

1) DPPH·活性清除

將1 mg/mL樣品溶液用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為2，4，6，8和10 mg/mL溶液。分別取3 mL上述溶液于試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液，混勻后避光靜置1 h，在517 nm處測(cè)定吸光度（用原溶劑作參比）。同時(shí)將3 mL溶劑（無水乙醇）與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液混合，測(cè)定其在517 nm處的吸光度。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，臨用前用去離子水配制成與待測(cè)物溶液同等濃度的對(duì)照液。蒸餾水做空白對(duì)照[17]。

按照式（2）計(jì)算不同濃度待測(cè)物的DPPH自由基清除率。

式中：Ai為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH·溶液；Aj為3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇；Ac為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH·溶液。

2) ·OH清除活性

將待測(cè)物用無水乙醇分別稀釋成濃度0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，取1 mL上述待測(cè)物溶液于試管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L的H2O2溶液1 mL以啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴加熱30 min后終止反應(yīng)，于510 nm測(cè)定吸光度。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，臨用前用去離子水配制成與試驗(yàn)待測(cè)物溶液同等濃度的對(duì)照液，蒸餾水做空白對(duì)照[18]。

式中：Ax為1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液；Ax0為1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL無水乙醇；A0為1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同料液比對(duì)超高壓提取多糖得率的影響

固定其他因素不變，采用不同料液比進(jìn)行超高壓提取青錢柳多糖試驗(yàn)，研究不同料液比對(duì)超高壓提取青錢柳多糖的影響，其結(jié)果如圖2。

隨著料液比增加，青錢柳多糖得率逐漸增大，同時(shí)對(duì)不同料液比提取青錢柳多糖得率結(jié)果進(jìn)行方差分析（如表3）可知，不同料液比對(duì)青錢柳多糖得率結(jié)果影響顯著，隨著料液比增加，青錢柳多糖多率提高，但考慮到料液比增加給青錢柳多糖分離和后期干燥成本增大，綜合考慮，選取料液比1︰20（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 超高壓處理時(shí)間對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響

其他因素不變，改變超高壓條件下青錢柳提取時(shí)間，研究不同處理時(shí)間對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響，結(jié)果見圖3。

隨著超高壓保壓提取時(shí)間延長，青錢柳多糖提取率呈現(xiàn)出輕微增加趨勢(shì)，主要是由于隨著提取時(shí)間增加，青錢柳多糖進(jìn)入提取液中也隨之增加，但從圖3及表4方差分析表中可知，超高壓提取時(shí)間的變化對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響不顯著，這可能是與超高壓提取機(jī)制有關(guān)。超高壓提取的主要原理是通過使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力突然增大，細(xì)胞內(nèi)有效成分穿過細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的提取液中，達(dá)到提取目的，而時(shí)間相對(duì)來說影響不大，隨著時(shí)間延長，提取率逐漸趨于不變。

圖2 料液比對(duì)青錢柳多糖得率的影響

表3 方差分析表

圖3 超高壓提取時(shí)間對(duì)青錢柳多糖得率的影響

表4 方差分析表

2.3 不同提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

控制超高壓處理腔中水的溫度從而達(dá)到控制提取溫度的目的。不同提取溫度對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響結(jié)果見圖4。

隨著提取溫度升高，青錢柳多糖得率有先提高后降低趨勢(shì)，提取溫度40 ℃時(shí)，青錢柳多糖的提取得率最高。對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，提取溫度對(duì)青錢柳多糖提取率影響顯著，高溫提取反而不利于青錢柳多糖溶出。

圖4 提取溫度對(duì)青錢柳多糖得率的影響

表5 方差分析表

2.4 超高壓提取壓力對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響

不同超高壓處理壓力對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響結(jié)果見圖5。

壓力是超高壓提取過程中的重要影響因素，表6方差分析可證明壓力對(duì)青錢柳多糖提取得率影響顯著。由圖5可知，隨著處理壓力升高，青錢柳多糖的提取率逐漸升高，至500 MPa時(shí)提取得率最高，而隨后變化不大。

圖5 提取壓力對(duì)青錢柳多糖提取得率的影響

表6 方差分析表

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化超高壓提取工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及單因素試驗(yàn)方差分析，剔除對(duì)青錢柳多糖得率影響不顯著的因素，確定以提取液料比、提取溫度及超高壓壓力進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，獲得超高壓提取青錢柳多糖最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果如表7。

正交試驗(yàn)可知，青錢柳提取多糖的最佳工藝為A3B1C2，即最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1︰25（g/mL），溫度30 ℃，提取壓力500 MPa。在此最佳條件下，青錢柳多糖得率為3.70%。

表7 超高壓萃取青錢柳多糖工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.6.1 DPPH·清除活性測(cè)定結(jié)果

DPPH·具有單一電子，所以能接受一個(gè)電子或氫離子，其乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm下具有最大吸收。自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·單電子被配對(duì)從而吸收消失或減弱，顏色從紫色逐漸變成黃色，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析，間接評(píng)價(jià)該自由基清除劑活性?？寡趸芰τ们宄时硎?，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。體外測(cè)定的青錢柳多糖對(duì)DPPH·清除效果見圖6青錢柳多糖對(duì)自由基的清除能力，可看出青錢柳多糖的清除DPPH自由基活性總體上小于陽性對(duì)照VC，但其清除DPPH自由基活性隨樣品濃度增加而增大，青錢柳質(zhì)量濃度從16.125 μg/mL增加到250 μg/mL時(shí)，其清除DPPH自由基能力迅速增加，達(dá)到93%，但與VC清除率仍有差距（99.9%）。青錢柳多糖對(duì)DPPH·清除效果與吳菲菲等、應(yīng)瑞峰等和葛霞等研究結(jié)果一致[19-22]，但通過比較其提取的青錢柳多糖的清除自由基能力，相對(duì)于超聲波提取及水提醇沉及沸水浴等方法提取青錢柳多糖，超高壓提取的青錢柳粗多糖的DPPH·清除能力93%比超聲波提取的青錢柳多糖清除能力更強(qiáng)，青錢柳多糖濃度更低，這與超高壓提取技術(shù)的低溫、短時(shí)、對(duì)多糖活性破壞小等優(yōu)點(diǎn)相關(guān)。

2.6.2 ·OH清除活性測(cè)定結(jié)果

和其他自由基相比，羥自由基是體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，產(chǎn)生于生命活動(dòng)的氧化代謝過程，可使氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪類和核酸等大分子發(fā)生氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使轉(zhuǎn)化細(xì)胞脫離正常細(xì)胞的控制無限生長而癌變，由圖7可以看出，青錢柳多糖對(duì)羥自由基有一定清除活性，最高清除率是50.3%。維生素C質(zhì)量濃度在0.4～1.0 mg/mL時(shí)，清除活性均在90%以上，由此看出青錢柳多糖的清除羥自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陽性對(duì)照維生素C。這與吳菲菲等、葛霞等和胡紅忠[19,21-22]的研究結(jié)果一致，而相對(duì)于不同提取方法，超高壓提取則沒有表現(xiàn)出明顯區(qū)別。

圖6 青錢柳多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖7 青錢柳多糖對(duì)羥自由基的清除活性

3 結(jié)論

通過單因素與正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)超高壓提取青錢柳多糖工藝參數(shù)，同時(shí)對(duì)得到青錢柳多糖進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果表明，青錢柳多糖最佳提取條件為料液比1︰25（g/mL），提取溫度30 ℃，提取壓力500 MPa，此時(shí)得率最高，為3.70%。超高壓提取的青錢柳葉多糖具有一定抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基有較好清除作用，且相對(duì)于其他提取方式，其活性較高這為青錢柳多糖的高效、高活性提取提供參考，但超高壓提取對(duì)青錢柳多糖的具體成分變化尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。