史成成 寧馨 李穎

摘要 以花果發(fā)育周期2年的麻櫟（Quercus acutissima）為試驗材料，測試不同組織制片軟化方案，摸索適合石蠟切片顯微制片方法，并對不同軟化處理后的材料進行切片和花粉管熒光染色，以確定對下游試驗的影響。結(jié)果表明，對于雌花發(fā)育早期，花柱及子房壁木質(zhì)化程度較低的材料，采用1.0 mol/L NaOH、1.0 mol/L HCl和10% Na2SO3高溫高壓軟化各1.5 h，均可在1 d內(nèi)完成軟化及解剖，但對木質(zhì)化程度高的雌花材料效果不佳。甘油乙醇軟化劑、冰醋酸軟化2種方法軟化木質(zhì)化程度高的雌花材料有一定軟化效果，但耗時較長，處理需14～180 d。采用5%乙二胺溶液，40 ℃處理對高木質(zhì)化雌花進行軟化效果最佳，僅需2～4 d即可達到預期。經(jīng)乙二胺軟化后材料褐化明顯，需要進一步漂白，對下游組織染色有一定影響，但仍為高木質(zhì)化雌花軟化的最佳處理方法。該研究為高木質(zhì)化花材料的顯微制片軟化方案提供重要解決方案。

關鍵詞 櫟屬;高度木質(zhì)化雌花;組織軟化方法;顯微制片

中圖分類號 S792.181 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0004-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract Quercus acutissima， a biannual fruiting species was used to optimize the tissue softening protocols that were suitable for paraffin section. Moreover， ?the pollen tubes using Aniline Blue were ?stained ?to assess the possible sideeffects of the softening to the downstream experiments. The results showed that the softening on the early developing stage pistillate with lignification could be well achieved using 1.0 mol/L NaOH or 1.0 mol/L HCl or using 10% Na2SO3 to autoclave for 1.5 hours， respectively， but these methods did not work well on the highly lignified pistillate flowers at later developing stage. The traditional glycerolethanol softening and glacial acetic acid soften methods took a long time （more than 14 days up to 180 days） to soft the flower， which was unpractical. Using 5% ethylenediamine solution at 40 ℃ could efficiently soften the highlignified pistillate female flowers within 2-4 days， which was the best timecost efficient method to soften the high lignified flowers. However， this protocol would cause severe tissue browning， which required further whitening treatment using 0.3% bleach. This paper provided an comprehensive solution to proceed the microtome study on highly lignified flowers at different developing stage.

Key words Quercus;Lignified pistillate flowers;Tissue softening protocol;Microtome

植物的受精、生殖是生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，并與其適應性具有密切關系[1]。比較形態(tài)解剖學通過對植物花部的解剖觀察、顯微制片等，分析花的生長發(fā)育和受精的過程，在植物受精生物學中被廣泛運用[2]。其中，顯微制片技術能明確顯示花發(fā)育的特定時期形態(tài)組織精細的變化過程，而被廣泛運用于植物的生殖和發(fā)育研究中[3]。但與其他方法相比，顯微制片的觀察方法也存在一些局限，如前處理流程較為繁瑣，需要探索適合的樣品硬度、包埋介質(zhì)才能得到良好的切片效果[4]。目前，在植物比較形態(tài)解剖學中常用的方法為石蠟切片法[5]，這一方法對研究材料的硬度有較高的要求，如果材料過硬，會劃碎蠟帶，難以獲得形態(tài)完整的切片用于下游試驗觀察。因些，探索樣品的軟化前處理方案是石蠟切片技術獲取高質(zhì)量切片的關鍵。

殼斗科（Fagaceae）是被子植物中薔薇亞綱（Rosidae）金縷梅目（Fagales）中最為特化的一個分支，花為單性，雄花為柔荑花序，而雌花單生或雙生于葉腋，均為無被花[6]。殼斗科的雌花生長節(jié)律較為特化，普遍存在雌花授粉至授精前有一段較長的休眠期（2—13月）[7]。在授粉期雌花較為幼嫩，而在后期發(fā)育中雌花子房壁和苞片木質(zhì)化程度高，十分堅硬，難以進行顯微制片對其生殖發(fā)育規(guī)律進行解剖觀察，為其受精和生殖生物學的開展帶來一定困難[8]。殼斗科植物具有重要的林業(yè)和經(jīng)濟價值[9]，深入開展這一類群受精生物學、生殖節(jié)律的研究，可為殼斗科植物的育種和保護提供重要技術資料。

目前，殼斗科雌花形態(tài)和受精生物學的相關研究有限，主要集中于花果發(fā)育周期為一年的栗屬Castanea[9]和櫟屬Q(mào)uercus[10]中，對于花果發(fā)育周期為2年、雌花木質(zhì)化程度高的石櫟屬、栲屬和櫟屬的研究較少，對植物雌花組織制片的軟化尚無良好解決方案。筆者選取櫟屬Q(mào)uercus中花發(fā)育到果實成熟需要2年且雌花木質(zhì)化程度較高的麻櫟（Quercus acutissima）雌花為材料，定期收集不同生長時期的雌花，采用現(xiàn)有顯微制片的不同組織軟化方法，對其不同發(fā)育時期的雌花進行軟化處理，篩選適合雌花材料顯微制片的組織軟化處理方案，為后續(xù)殼斗科生殖生物學研究的開展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料麻櫟的雌花采集于上海辰山植物園內(nèi)（121°11′5.76″ E、31°04′48.10″ N）引種的成熟植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同時期雌花材料的采集和固定。

為追蹤麻櫟2年生雌花不同發(fā)育過程，自2017年4月初麻櫟開花伊始進行采集。4月初采集頻率為7 d/次;5月麻櫟花粉管進入休眠期，采集頻率為1月/次;至翌年麻櫟進入第二年生長季，4月底其花粉管恢復生長，樣品采集頻恢復為7 d/次，直至2018年9月果實成熟。每次采集40～50朵雌花。收集的雌花迅速放于FAA固定液（70%乙醇：5%乙酸：5%福爾馬林）中進行固定，并抽真空 15 min，促使固定液快速滲透到雌花（果實）中，而后放于4 ℃冰箱中固定，7 d后轉(zhuǎn)移到70%乙醇中長期儲存于4 ℃冰箱，以備試驗待用[11-12]。

選取具有代表性時期的樣品進行軟化試驗。選取2018年當年生樣品：5月15日、8月15日、12月15日，2018年二年生樣品：4月15日、6月15日5個時期的樣品運用不同試驗方法進行軟化處理。

1.2.2 麻櫟不同時期雌花的軟化試驗方案。

解剖前處理：對于當年生花柱及外部總苞木質(zhì)化程度較低的麻櫟雌花進行簡單處理，將花柄及最外層苞片切掉即可;對于較硬、木質(zhì)化程度嚴重的2年生雌花，須去除外部總苞及部分木質(zhì)化的子房外壁，以便軟化劑進入雌花。

在前人研究的基礎上加以改進，具體軟化方法和步驟：

（1）NaOH（氫氧化鈉）軟化法。

軟化參考前人對竹子等軟化木質(zhì)素的方法[13-14]。選取5個時期的待軟化樣品各10枚于試管中，加入試驗材料5倍及以上樣品體積的1 mol/L NaOH，于60 ℃恒溫水浴1.5 h，期間取出樣品用解剖針檢測軟化程度，至解剖針可輕易插入樣品內(nèi)部。NaOH溶液加熱時間可根據(jù)需解剖材料的木質(zhì)化程度進行調(diào)整。NaOH軟化會使試驗材料褐化，其軟化后的材料需采用50% NaClO（次氯酸鈉）漂白，直至試驗材料變?yōu)榘咨Ｓ捎贜aClO具有腐蝕性[15]，也對試驗材料有軟化作用，需要隨時進行觀察，待材料變?yōu)榘咨皶r取出。

（2）HCl（鹽酸）軟化法。

依據(jù)HCl的強腐蝕性軟化試驗材料[16]。5個時期的試驗材料各10枚置于5倍及以上樣品體積的1 mol/L HCl溶液，進行沸水浴1.5 h達到軟化效果。具體軟化時間根據(jù)試驗材料軟硬程度而定。將試驗樣品在無菌水或30%乙醇中解剖，觀察軟化效果，若雌花材料仍較硬，可繼續(xù)進行沸水浴軟化處理，直至解剖針可毫不費力插入樣品內(nèi)部。

（3）Na2SO3（亞硫酸鈉）高溫高壓軟化法。

按質(zhì)量體積比配制10%的Na2SO3溶液。選取同上5個時期的麻櫟雌花各10枚，將已經(jīng)木質(zhì)化的苞片及子房壁剖去后，置于配制好的溶液中，溶液體積為樣品體積的5倍及以上。高壓滅菌鍋調(diào)至121 ℃，進行1.5 h的高溫高壓來軟化組織[17]，降溫后檢測軟硬程度。若材料仍較硬，將試驗材料于NaClO中漂白，直至達到軟化效果。

（4）甘油-乙醇軟化法。

采用甘油-乙醇軟化法[18]，即采用甘油和95%乙醇按1∶1配制為混合液。將5個時期的試驗樣品各10枚浸于5倍樣品體積的軟化劑中進行軟化，為期180 d。軟化后樣品用無菌水漂洗，將甘油沖洗干凈，進行脫水、透明、切片，檢測軟化后樣品。

（5）CH3COOH（冰醋酸）軟化法。

雌花樣品經(jīng)FAA固定、乙醇預處理后，增加了以冰醋酸軟化木質(zhì)部這一步驟，用正丁醇（CH3（CH2）3OH）取代二甲苯進行組織透明，其余步驟參考常規(guī)方法。具體方法：選取FAA中5個時期的麻櫟雌花樣品各10枚分別進行梯度乙醇脫水、軟化透明、透蠟及染色，具體步驟如下：80%乙醇1 h→ 95%乙醇1 h→ 100%乙醇1 h×2次→ 冰醋酸48～72 h→ 冰醋酸/無水乙醇（V∶V=1∶3）1 h→ 無水乙醇1在h×2次→ 100%乙醇/正丁醇（V∶V=1∶1）1 h→ 正丁醇Ⅰ 2 h→ 正丁醇Ⅱ 2 h→正丁醇/石蠟（V∶V=1∶1）45 ℃→ 石蠟45 ℃，每日升高2 ℃，直至65 ℃→ 包埋→ 切片（10 μm）→ 貼片→ 展片→ 中和pH→ 苯胺藍染色12 h→ 鏡檢[19]。

（6）C2H8N2（乙二胺）軟化法。

將乙二胺稀釋至濃度5%乙二胺溶液，需進行顯微制片的試驗材料在脫水前用5%乙二胺溶液在60 ℃下軟化處理4 d，再采用常規(guī)脫水、透明步驟進行石蠟切片[9，18]。

具體步驟：取5個時期已固定樣品各10枚浸于5%乙二胺溶液中，60 ℃溫箱中軟化4 d，由于樣品褐化為黑色，軟化后的材料需用50%NaClO漂白，直至試驗材料變?yōu)榘咨?0～20 min。

1.2.3 不同軟化處理后的熒光顯微觀察。

采用0.1%水溶性苯胺藍對花粉管胼胝質(zhì)染色[20-22]，來觀察花粉管在雌花內(nèi)生長發(fā)育節(jié)律，以確定花粉管的休眠時間及位置。0.1%苯胺藍配制方法參考Currier等[23]的方法，即0.1 g苯胺藍溶于0.01 mol/L K3PO4溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0。軟化后組織在染色之前需置于磷酸緩沖液中浸泡，以調(diào)整pH，磷酸緩沖液配制方法：1 mol/L K2HPO4、1 mol/L KH2PO4混合液，調(diào)節(jié)pH至7.0。

（1）壓片法熒光顯微觀察。

軟化后的樣品用去離子水漂洗2遍，每次漂洗10 min。漂洗后的樣品于磷酸緩沖液中，中和pH，大于30 min，然后將試驗材料浸泡于1%苯胺藍染液中染色12 h，后將染色后的麻櫟雌花放入2個載玻片中用力壓平，甘油封片。在熒光顯微鏡（DM6000B，Leica）透過分色鏡（FT395），二次濾片（LP397），濾色后得到365 nm UV光對壓片進行觀察，并拍片[10-11，24]。

（2）石蠟顯微制片法觀察。

石蠟顯微制片方法以Stewart[5]的標準石蠟切片法為基礎，在此方法基礎上進行改進，具體步驟：將軟化及漂白后的麻櫟雌花進行30%、50%、70%、85%、95%梯度乙醇脫水，每梯度中樣品分別停留1.5 h，然后采用無水乙醇脫水2次，每次30 min。透明采用乙醇—二甲苯系列進行（乙醇∶二甲苯= 2∶1、1∶1、1∶2每梯度1.5 h）梯度透明，最后在純二甲苯中分別浸泡2次/1 h。將已透明樣品轉(zhuǎn)入42 ℃緩慢升溫透蠟，每天升溫2 ℃，直至65 ℃，后用純石蠟（Plaphoast 65 ℃）質(zhì)換2次，在包埋臺上用65 ℃熔點石蠟進行包埋。包埋后樣品采用Leica切片機進行顯微制片，根據(jù)切片質(zhì)量，推斷軟化效果。切片厚10 μm，脫蠟復水后，將玻片置于1%苯胺藍染液染色12 h，后置于熒光顯微鏡（DM6000B，Leica）下用365 nm 的紫外光進行觀察，對比切片質(zhì)量[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同軟化方法的比較

不同時期的試驗材料，由于木質(zhì)化程度不同，采用6種軟化方法對樣品組織軟化效果有明顯差異。通過石蠟切片法對麻櫟雌花的進行切片，判斷6種軟化方法的效果，具體軟化差異對比見圖1。對于當年生、木質(zhì)化程度低的雌花樣品，采用Na2SO3（圖1A）、HCl（圖1B）和NaOH（圖1 C）均可達到軟化效果，其中Na2SO3軟化最為理想。對于木質(zhì)化程度略高的2年生雌花樣品，冰醋酸軟化（圖1 D）和甘油-乙醇軟化（圖1 E）效果差，在蠟帶上會出現(xiàn)明顯劃痕裂隙（圖1黑色箭頭所指）。乙二胺溶液所軟化樣品切片（圖1F），在體視鏡下觀察，可以清晰看到保存完整的胚珠，軟化效果最佳。

2.2 不同軟化處理對樣品后期熒光染色的影響

試驗材料下游熒光染色效果受軟化試劑pH影響，具體熒光染色效果對比見圖2。NaOH溶液（圖2 A）、HCl溶液（圖2 B）、乙二胺軟化（圖2 C）以及Na2SO3高溫高壓軟化（圖2 D）的組織，苯胺藍染色后均可觀察到花粉管的熒光信號（圖2白色箭頭所指）。10% Na2SO3高溫高壓軟化法所軟化的早期雌花樣品的壓片中可清楚觀察到聚集于花柱偏上1/3處的花粉管;乙二胺溶液軟化的木質(zhì)化程度較高，樣品壓片所觀察到的花粉管最為清晰，主要分布于花柱下部1/3處。經(jīng)冰醋酸軟化樣品（圖2 E）和乙醇-甘油軟化樣品（圖2 F）苯胺藍染色后鏡檢，無法觀察到花粉管的熒光信號。不同方法的軟化效果和對下游苯胺藍染色的影響見表1。不同氧化方法優(yōu)、缺點對比見表2。

3 討論

在花粉管生長過程中，授粉后麻櫟花柱會較快木質(zhì)化并變硬，因此，花柱軟化及受精前子房壁軟化是試驗關鍵環(huán)節(jié)[8]。在顯微制片中，植物材料的前處理主要可分為物理軟化法和化學軟化法兩大類，它們通過改變細胞壁分子結(jié)構(gòu)和宏觀性能，溶解和破壞木材內(nèi)部纖維素等物質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞其穩(wěn)定性以達到軟化效果[25]。該研究對幾種常用組織軟化方法進行測試，所采用的6種軟化試劑均為腐蝕性化學試劑，常用于木材、竹材的軟化加工[13]。

研究表明，對于木質(zhì)化程度較低的試驗材料，如當年生麻櫟雌花及恢復生長前的2年生麻櫟雌花木質(zhì)化程度低，采用常規(guī)化酸、堿和高溫高壓軟化均可以獲取良好的軟化效果，其中亞硫酸鈉高壓軟化用時最快、軟化效果最佳、無褐化、簡單快捷，為首選軟化方法。對于木質(zhì)化程度高、多骨質(zhì)、多石細胞的試驗材料，有軟化效果的3種方法為乙醇甘油軟化劑、冰醋酸和乙二胺，其中乙醇甘油軟化劑和冰醋酸軟化所需時間長，且軟化期間試劑滲入試驗材料內(nèi)部，不易被緩沖液置換，為下游組織的染色帶來一定困難，不適用于花比較形態(tài)解剖學的組織軟化處理。乙二胺溶液軟化法明顯縮短了試驗時間，最為方便快捷，對下游染色影響最小，在現(xiàn)有方法中有明顯的優(yōu)勢，更適于木質(zhì)化材料的顯微制片軟化處理。

在軟化過程中會改變樣品（或組織）的pH，進而可能會對下游熒光染色造成較大影響，軟化后樣品（或組織）中軟化劑和緩沖液是否置換完全，是熒光染色試驗成敗的關鍵[14]。顯微組織觀察試驗表明，熒光染色樣品以pH 6.7為最適，此時花柱與背景的顏色對比明顯，可清晰觀察到花粉管，pH低于或高于6.7均無法觀察到結(jié)構(gòu)完整的花粉管[26]。

植物發(fā)育不同時期，木質(zhì)化程度不同，所應用的軟化方法、軟化劑的濃度以及軟化時間也隨之變化;無論哪種軟化方法，針對木質(zhì)化程度不同的試驗材料，其濃度和軟化時間均要進行相應調(diào)整。該研究探索了一套適合于殼斗科櫟屬高木質(zhì)化雌花石蠟切片制片的軟化處理方法，為今后開展殼斗科植物的受精生物學和胚胎學研究奠定了基礎。

參考文獻

[1]胡適宜.被子植物胚胎學[M].北京：人民教育出版社，1982：67-101.

[2]劉明英.百合科植物比較形態(tài)解剖學研究——Ⅱ.萬年青、吉祥草、紫花玉簪、蘆薈、吊蘭后生木質(zhì)部管狀分子的比較解剖[J].四川大學學報（自然科學版），1992，29（1）：149-154.

[3]李正理.植物組織制片學[M].北京：北京大學出版社，1996：50-161.

[4]葉寶興，畢建杰，孫印石.植物細胞與組織研究方法[M].北京：化學工業(yè)出版社，2011：54-63.

[5]STEWART J A.Manual of histological techniques and their diagnostic application[J].Histopathology，1995，26（1）：95.

[6]HUANG C J，ZHANG Y T，BRUCE B.Fagaceae[M]//WU Z Y，RAVEN P H.Flora of China Cycadaceae through Fagaceae.Beijing：Science Press and Missouri Botanical Garden Press，1999：314-400.

[7]SOGO A，TOBE H.Delayed fertilization and pollentube growth in pistils of Fagus japonica（Fagaceae）[J].American journal of botany，2006，93（12）：1748-1756.

[8]BORGARDT S J，NIXON K C.A comparative flower and fruit anatomical study of Quercus acutissima，a biennialfruiting oak from the Cerris group（Fagaceae）[J].American journal of botany，2003，90（11）：1567-1584.

[9]鄧敏.殼斗科櫟屬青岡亞屬的形態(tài)解剖、分類、分布及其系統(tǒng)演化[D].昆明：中國科學院昆明植物研究所，2007：30-70.

[10]許慧玲，曹慧娟，李天慶.板栗（Castanea mollissima B1.）的胚胎學研究——（I）胚珠、胚囊發(fā)育、受精和胚發(fā)生[J].北京林業(yè)大學學報，1988，10（1）：10-16.

[11]許晨光，劉澤濤，苑少華，等.不同固定液對小麥花粉母細胞微絲骨架熒光標記的效果[J].作物雜志，2012（4）：13-16.

[12]DENG M，ZHOU Z K，CHEN Y Q，et al.Systematic significance of the development and anatomy of flowers and fruit of Quercus schottkyana（Subgenus Cyclobalanopsis：Fagaceae）[J].International journal of plant sciences，2008，169（9）：1261-1277.

[13]趙瑞艷，付釣鈞，孫婷.不同軟化處理方法對竹材質(zhì)量的影響[J].佳木斯大學學報（自然科學版），2009，27（4）：637-640.

[14]程云清，張會弟，劉劍鋒.榛子木質(zhì)化花柱軟化方法的改進[J].吉林師范大學學報（自然科學版），2015（3）：125-128.

[15]邱立軍，趙維忠，孫開英，等.次氯酸鈉殺滅微生物效果與腐蝕性的試驗觀察[J].中國消毒學雜志，1998，15（2）：110-112.

[16]張明宇.快速離析干燥木材的方法[J].生物學通報，2000，35（1）：43.

[17]BOAVIDA L C，VARELA M C，F(xiàn)EIJO J A.Sexual reproduction in the cork oak（ Quercus suber L.）.I.The progamic phase[J].Sexual plant reproduction，1999，11（6）：347-353.

[18]胡玉熹，林金星.高度木質(zhì)化材料軟化的簡便方法[J].植物雜志，2000（3）：31.

[19]蔡海濱，涂敏，胡彥師，等.一種優(yōu)化的橡膠樹木質(zhì)部石蠟切片制作方法[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2015，35（6）：25-28.

[20]王秀文.石蠟切片法中染色技術的改良[J].植物研究，2015，35（1）：158-160.

[21]CECICH R A.Pollen tube growth in Quercus[J].Forest science，1997，43（1）：140-146.

[22]KHO Y O，BAR J.Observing pollen tubes by means of fluorescence[J].Euphytica，1968，17（2）：298-302.

[23]CURRIER H B，STRUGGER S.Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L[J].Protoplasma，1956，45（4）：552-559.

[24]李師翁，屠驪珠.用苯胺藍壓片法觀察小孢子和雄配子體發(fā)育過程中胼胝質(zhì)的動態(tài)[J].植物學通報，1990，7（1）：60-63.

[25]謝延軍，符啟良，王清文，等.木材化學功能改良技術進展與產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀[J].林業(yè)科學，2012，48（9）：154-163.

[26]朱書生，劉西莉，劉鵬飛，等.6種染色方法對黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段的染色效果比較[J].植物病理學報，2006，36（1）：86-90.