馬瑞欣 蘇歡歡 周凡 李雪萍 王曉靜

摘要：建立了液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC-MS/MS）同步檢測魚蝦中的喹乙醇（OLA）及其代謝標示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的方法。樣品用0.1 mol/L的鹽酸37 ℃水解16 h，水解液乙腈萃取，正己烷去脂，HLB固相萃取柱凈化，LC-MS/MS分析，內(nèi)標法定量。結(jié)果表明，OLA和MQCA在1.00～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，方法檢出限為0.50 μg/kg，定量限為1.00 μg/kg。在1.00、2.00、10.0 μg/kg加標水平下，OLA平均回收率為84.5%～107.0%，MQCA平均回收率為74.0%～106.0%，相對標準偏差（RSD）均小于10%。該方法靈敏度高，操作簡單，可適用于魚蝦肌中喹乙醇及其代謝標示物的同步檢測。

關(guān)鍵詞：喹乙醇;3-甲基喹噁啉-2-羧酸;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）;魚蝦;同步檢測

喹乙醇又名酰胺醇，商品名有快育諾、倍育諾、快育靈等，具有廣譜抗菌和促進生長的雙重作用。該藥物曾被作為添加劑廣泛用于畜、禽、魚、蝦飼料中[1]。喹乙醇在可食動物源性食品中的殘留對人類有潛在的三致性[2-3]，其在美國和歐盟都被禁止用作飼料添加劑。2005版《中國獸藥典》明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。2018年1月11日頒布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第2638號公告規(guī)定停止在食品動物中使用喹乙醇。3-甲基喹噁林-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇主要代謝物之一，其在體內(nèi)相對穩(wěn)定，被定為喹乙醇在動物體內(nèi)代謝的殘留標示物[4]。

目前水產(chǎn)品中喹乙醇及其代謝標示物的定量檢測方法主要有液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。這些檢測方法中OLA和MQCA的前處理和上機分析是分別進行的，不能通過前處理同時提取OLA和MQCA。關(guān)于OLA和MQCA同步檢測的文章也有報道[12-13]，但由于MQCA與蛋白緊密結(jié)合，僅采用酸溶液提取很難將MQCA充分提取出來，而且水產(chǎn)品的酸提取液比較渾濁，直接通過固相萃取柱困難，造成可操作性差。液相色譜法使用紫外檢測器或DAD檢測器，檢測水產(chǎn)品中的MQCA時干擾較大，靈敏度低且易出現(xiàn)假陽性。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜選擇性強、靈敏度高，在定性定量檢測方面具有相當?shù)膬?yōu)勢，因此本文建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同步測定魚蝦中的OLA和MQCA的方法，可對OLA和 MQCA同步進行前處理和檢測，減少了實驗步驟;同時對前處理方法進行了改進和優(yōu)化，可操作性增強。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜（日本島津）;QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX ）;十萬分之一電子天平（賽多利斯）;百分之一電子天平（賽多利斯）;SHA-B雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器（上海梅香儀器有限公司）;平行蒸發(fā)儀（瑞士BUQI）;Milli-Q超純水儀（美國Millipore）;TDZ5-WS離心機（湖南湘儀）;MS3渦旋混合器（IKA）;JYS-A8000絞肉機（九陽）。

喹乙醇（OLA，純度97.89%，Dr. Ehrenstorfer）;喹乙醇-D4（OLA- D4，純度（99.1±02）%，WiTEGA）; 3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA，純度97.0%，Dr. Ehrenstorfer） ;3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4（MQCA-D4，純度（100±2.0）%，BePure）。乙腈和甲醇（HPLC Grade，Merck）;甲酸（HPLC Grade，DIKMA）;鹽酸（優(yōu)級純，北京化工廠）;氯化鈉（GR，國藥）;HLB固相萃取柱：3 mL，60 mg（waters）;濾膜：0.2 μm GHP（PALL），實驗用水為超純水。

1.2試樣制備

魚去鱗、去皮，沿脊背取肌肉部分;蝦去頭、殼，取肌肉部分，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混勻，絞肉機絞碎，裝入潔凈容器中，密封，-18℃以下冷凍保存。

1.3樣品前處理方法

稱取樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心試管中，準確加入1.00 mg/L的混合內(nèi)標中間液50 μL，渦旋混合均勻，加入15 mL 0.1 mol/L鹽酸，渦旋混勻2 min ，置于37 ℃水浴避光振蕩16 h，取出冷卻至室溫，加入5 g氯化鈉，15 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，取上層乙腈層至蒸發(fā)管中，再加入10 mL乙腈萃取一次，合并乙腈層，40 ℃蒸去乙腈。加入3 mL水洗滌蒸發(fā)管內(nèi)壁殘渣，溶液轉(zhuǎn)入15 mL離心試管中，再用3 mL水洗滌一次，合并溶液。溶液中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，再加入5 mL正己烷重復(fù)操作一次。下層溶液待凈化。

HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸活化后，加入待凈化溶液， 不抽真空，讓其在重力作用下自然通過固相萃取柱，用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干，加入 3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，40 ℃氮氣吹干。加入1.00 mL水溶解，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱phenomenex Kinetex C18（100×2.1 mm， 2.6 μm），柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量5 μL，流動相A為0.15%（V/V）甲酸水溶液，B為0.15%（V/V）甲酸甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B;1～3 min，5%B～90%B;3～4 min，90%B;4～4.1 min，90%B～5%B;4.1～7 min，5%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)掃描（MRM）正離子模式，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣30 PSi， 碰撞氣Medium;溫度550 ℃;霧化氣：55 PSi;輔助加熱氣：55 PSi。質(zhì)譜條件及參數(shù)見表1。表1多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜條件及參數(shù)

1.5標準溶液配制

用十萬分之一電子天平稱取適量標準物質(zhì)，用甲醇溶解并定容，配制成100 mg/L標準儲備液，-18 ℃以下避光保存。分別取適量標準儲備液，用甲醇分別稀釋成1.00 mg/L的OLA和MQCA的混合標準中間液、1.00 mg/L的OLA- D4和MQCA-D4混合內(nèi)標中間液，-18 ℃以下避光保存。

取混合標準中間液和混合內(nèi)標中間液，用水稀釋成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 μg /L的標準系列，內(nèi)標為50.0 μg /L。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理條件的建立

MQCA含有-COOH，易與蛋白質(zhì)結(jié)合，可采用酸水解[7]、酶水解[9-11]、堿水解[14-17]的方法使MQCA游離出來。采用酸水解的方法可使MQCA保持分子形式，有利于后續(xù)步驟中MQCA和OLA進入乙腈層;OLA比較穩(wěn)定，質(zhì)譜圖中子離子m/z 143.1和m/z 212.1信號比較強，干擾少，酸水解對OLA的提取和穩(wěn)定性無明顯影響。本文比較了 0.1 mol/L l、0.2 mol/L、2 mol/L的鹽酸水解16 h后的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酸的濃度越高，有些樣品（如對蝦）水解過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，質(zhì)譜圖中MQCA子離子m/z 144.9和m/z 142.9強度低、干擾大，造成回收率不穩(wěn)定;而采用0.1 mol/L的HCl水解16 h后，樣品成為均一的懸濁液， m/z 144.9和m/z 142.9信號較高，干擾小，回收率穩(wěn)定。參考相關(guān)文獻[18]，本實驗確定水解條件為0.1 mol/L的鹽酸，37℃水浴避光振蕩16 h。

由于MQCA分子量小，離子碎片信息少，且LC-MS/MS檢測時干擾多，本實驗采用乙腈萃取、正己烷去脂和HLB固相萃取柱凈化的方式對樣品提取液進行凈化。利用基質(zhì)加標溶液對凈化過程中使用淋洗液的種類、濃度和體積進行了試驗，發(fā)現(xiàn)用水淋洗時OLA有損失，10%的甲醇淋洗時OLA和MQCA均損失較多，故采用5%甲醇進行淋洗。使用3 mL 5%甲醇淋洗后，對蝦樣品中MQCA的干擾峰仍較強，使用6 mL 5%甲醇淋洗后，干擾峰明顯變?nèi)酰适褂? mL 5%甲醇進行淋洗。試驗發(fā)現(xiàn)3 mL甲醇能充分將OLA和MQCA洗脫下來，故最后洗脫采用3 mL甲醇。

乙腈萃取時，水解液中加入氯化鈉，增加水溶液的密度，有助于水相和乙腈的分層。通過萃取，減少了水溶性雜質(zhì)的干擾和乙腈蒸發(fā)過程中出現(xiàn)爆沸的情況。樣品溶液經(jīng)過乙腈萃取，水復(fù)溶，正己烷去脂處理后，溶液澄清，HLB柱凈化時過柱通暢，柱子不會堵塞，進一步增強了實驗的可操作性。

2.2流動相的選擇

流動相中加入甲酸，可提高目標物子離子信號強度;加入乙酸銨對MQCA的m/z 142.9離子有增強作用，但對MQCA-D4的m/z 149.0和MQCA的m/z 144.9信號強度有明顯抑制作用;采用梯度洗脫，可增加柱效和分離度。故選擇015%甲酸水溶液和0.15%甲酸甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫。

2.3線性范圍

OLA以O(shè)LA-D4為內(nèi)標，MQCA以MQCA-D4為內(nèi)標;以面積比為縱坐標，以濃度比為橫坐標繪制校準曲線。由圖1可以看出，OLA和MQCA在1.00 μg /L～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)r大于0.999。標準溶液的OLA和MQCA多反應(yīng)掃描質(zhì)量色譜圖見圖2。

2.4檢出限和定量限

實驗選擇草魚、鯉魚、金鱒、南美白對蝦、中國對蝦等空白樣品，通過空白樣品添加標準溶液制得0.50、1.00、2.00、10.0 μg/kg的加標樣品，每個樣品均采用四梯度三平行進行實驗，按1.3進行前處理，1.4進行上機測試，標準曲線法進行定量。由表2和表3中數(shù)據(jù)可以看出，在0.50 μg/kg的添加量的情況下，信噪比大于等于3，但有些品種回收率低于70.0%，RSD大于15%，因此確定OLA和MQCA的檢出限為0.50 μg/kg;在1.00 μg/kg添加量的情況下，OLA回收率在845%～107.0%之間，RSD≤7.6%;，MQCA回收率在77.1%～106.0%之間，RSD≤5.5%，因此確定OLA和MQCA的定量限為1.00 μg/kg。

2.5回收率

表2數(shù)據(jù)表明在1.00～10.0 μg/kg的添加范圍內(nèi)，OLA回收率在84.5%～107.0%之間，標準偏差RSD≤8.0%;批間標準偏差RSD≤91%，見表4。表3數(shù)據(jù)表明在1.00～10.0 μg/kg的添加范圍內(nèi)，MQCA回收率在740%～106.0%之間，標準偏差RSD≤9.9%;批間標準偏差RSD≤14%，見表5。典型樣品的OLA和MQCA多反應(yīng)掃描質(zhì)量色譜圖見圖3和圖4。

2.6實際樣品檢測

采用所建立的方法對市場上采集的羅非魚、中國對蝦、鯉魚、草魚、大菱鲆和南美白對蝦6個品種共計32個樣品進行檢測，均未檢出喹乙醇及其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸。

3結(jié)論

本文建立了魚蝦中喹乙醇和其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸同步檢測的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法喹乙醇和其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟完全相同，實驗前處理可操作性強，準確度、精密度和檢出限等滿足檢測方法學(xué)的要求，可作為檢測魚蝦中是否使用喹乙醇的定性、定量方法。

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Simultaneous determination of olaquindox and its metabolic

marker in fish and shrimp

MA Ruixin1，2，SU Huanhuan1，2，ZHOU Fan1，2，LI Xueping1，2，WANG Xiaojing

（1.Hebei Provincial Center for Fisheries Technology Extension， Shijiazhuang 050035，China;

2.Hebei Inspection and Examination Center for Aquatic Products Quality， Shijiazhuang 050035，China）

Abstract：A liquid chromatography –tandem mass spectrometric method was developed to determine olaquindox （OLA） and its metabolic marker 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid（MQCA）simultaneously in fish and shrimp . Sample was hydrolyzed with 0.1 mol/L hydrochloric acid for 16 h at 37 ℃， the hydrolytic solution was extracted with acetonitrile， defatted with n-hexane and purified with HLB solid-phase extraction cartridge， detected by liquid chromatography –tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. The quantification was done by internal standard method. The analysts showed good linearity within the range 1.00～200 μg/L. The correlation coefficient （r） was greater than 0.999. The limit of detection was 0.50 μg/kg and the limit of quantitation was 1.00 μg/kg. At the three spiked levels of 1.0，2.0 and 10.0 μg/kg， the average recoveries of OLA were in range 845%～107.0% and MQCA in range 74.0%～106.0%. The relative standard deviations were below 10%. The proposed method is sensitive and easy to operate， it is suitable for detection of OLA and MQCA in fish and shrimp muscle tissues.

Key words：olaquindox （OLA）; 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid （MQCA）; liquid chromatography –tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; fish and shrimp

（收稿日期：2020-02-06）