王 貴 ，賈立群，鄧 博，吳夢雨，婁彥妮，李 園★

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結合腫瘤科，北京 100029）

圖4 小鼠腹水超聲圖

惡性腹水是多種惡性腫瘤晚期常見的并發(fā) 癥，可見于消化道腫瘤、卵巢癌、子宮癌、腹膜癌等，亦有20%的惡性腹水原發(fā)灶不明，約50%的惡性腫瘤病例以惡性腹水為表現(xiàn)或癥狀，預后差，生存期約1~6個月[1，2]。 惡性腹水引起的持續(xù)加劇的腹脹、疼痛、呼吸困難，嚴重影響患者的生活質量。 利尿劑、腹腔穿刺放液可暫時緩解癥狀，但不適宜頻繁使用[3]。 前期動物實驗研究[7，8]發(fā)現(xiàn)，實脾消水乳膏能夠明顯減少腹水量、 促進腫瘤細胞凋亡。 本研究旨在探究實脾消水乳膏對肝癌H22 惡性腹水小鼠的免疫調節(jié)功能的影響。

1 材料

1.1 藥物、動物與細胞

實脾消水乳膏由黃芪、桂枝、大腹皮、莪術、牽牛子、紅花、車前子、冰片8 味藥組成，由中日友好醫(yī)院中藥制劑所提供，40g/瓶，每克乳膏相當于生藥4.5g，臨床擬用劑量：0.1g/cm2，8h/d。 氫氯噻嗪片購于天津力生制藥股份有限公司 （國藥準字H12020166，批號1804008）。

健康雄性昆明小鼠，SPF 級，24 只， 體重18~22g， 購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK（京）2010-0001。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所動物實驗室（SPF 級），許可證號：SYXK（京）2016-0043。 癌細胞由H22 腹水型肝癌荷瘤小鼠腹水分離而來， 荷瘤小鼠購自中國協(xié)和細胞庫。

1.2 儀器與試劑

天平，離心機：美國sigma 公司；Visual Sonics小動物超聲儀：Fujililm。 全自動血細胞分析儀：日本光電工業(yè)株式會社； 流式細胞儀：BD FACS Canto； 抗小鼠CD4 FITC 單克隆抗體、 抗小鼠CD25 APC 抗體、抗小鼠Foxp3 PE 抗體、抗CD8單克隆抗體， 購自Tonbo 公司。 IL-2 （批號：190616）、IL-10 （批號：190421） 試劑盒購自美國eBioscience 公司。

2 方法

2.1 制備實脾消水乳膏

方中藥物除冰片外， 藥材加8 倍量的水回流提取2 次，每次2h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，用時將冰片以乙醇溶解后迅速加入，混勻，即得。

2.2 小鼠腹水瘤模型制備及分組給藥

取穩(wěn)定傳代至d7 的肝癌H22 腹水瘤小鼠，無菌抽取腹水，生理鹽水洗滌3 次，1500r/min，離心5min，棄上清，生理鹽水調節(jié)腹水細胞懸液濃度為2×107個/ml，小鼠腹腔注射配制好的細胞懸液0.2ml/只（約含H22 細胞4×106個細胞），復制肝癌H22 腹水瘤荷瘤小鼠。

將24 只小鼠隨機分為正常組（Ctrl）、模型對照組（Model）、氫氯噻嗪組（HCTZ）、實脾消水乳膏組（SPX），每組6 只。 除正常組外，其他組小鼠均于第0 天制作腹水瘤模型。 氫氯噻嗪組實驗開始予小鼠氫氯噻嗪13mg/kg 灌胃給藥； 實脾消水乳膏組實驗開始給予實脾消水乳膏，劑量0.1g/cm2，涂抹于褪毛后的整個腹壁， 并用保鮮膜膠帶固定8h。 每天給藥1 次，連續(xù)給藥14d。 正常組與模型對照組予等量的生理鹽水與空白基質制成的成型乳膏涂抹于腹部。

2.3 小鼠體重及腹圍的測量

研究開始至d14，隔日稱量小鼠體重，測量小鼠腹圍。將小鼠水平仰臥位固定放置，測量其髖關節(jié)上側腹部最膨隆部位圓周長， 記錄體重及腹圍值，繪制小鼠平均體重、腹圍變化曲線。

2.4 小鼠腹水量的測定

d14 褪去腹部毛后， 將小鼠水平仰臥位固定放置，使用小動物超聲儀測量各組小鼠腹水深度，取其腹腔積液最深處直徑。

2.5 小鼠臟器重量的測量

小鼠連續(xù)給藥14d 后，處死小鼠，取心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟，稱量其凈重。

2.6 小鼠血液學參數(shù)的測定

d14 處死小鼠，取血，血細胞分析儀分析小鼠紅細胞、血紅蛋白、白細胞總數(shù)、血小板計數(shù)、中性粒細胞百分比、單核細胞百分比、淋巴細胞百分比變化。

2.7 小鼠CD4+、CD8+T 淋巴細胞、Treg 細胞的測定

取小鼠靜脈全血，肝素抗凝后，加入紅細胞裂解液和不同熒光標記抗體，室溫避光孵育，磷酸鹽緩沖液沖洗，流式細胞分析儀檢測，記錄CD4+和CD8+T 淋巴細胞、Treg 細胞比例。

2.8 小鼠血清IL-2、IL-10 的表達

取小鼠靜脈血，分離血清，按ELISA 操作試劑盒說明，測定細胞因子IL-2、IL-10 的表達。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結果

圖1 各組小鼠體重的變化

圖2 各組小鼠腹圍的變化

圖3 各組小鼠腹腔積液最深直徑

3.1 各組小鼠體重及腹圍變化。

與正常組（Ctrl）比較，模型組（Model）小鼠體重增長迅速；與模型組比較，氫氯噻嗪組（HCTZ）體重增長緩慢，實脾消水乳膏組（SPX）小鼠體重增長趨勢明顯下調（P＜0.05）（見圖1）。 與正常組比較，模型組小鼠腹圍于d6 開始迅速增長，腹圍明顯增大（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，實脾消水乳膏組與氫氯噻嗪組小鼠腹圍增長趨勢緩慢（P＜0.05）（見圖2）。 小動物超聲儀檢測小鼠腹腔積液最深處直徑，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，實脾消水乳膏及氫氯噻嗪組小鼠腹水量降低（均P＜0.01），2組之間未見明顯差異（圖3，圖4 見封二）。

3.2 各組小鼠各臟器重量的變化

表1 示各組小鼠心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟各臟器重量的比較，我們發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠的心臟、脾臟、肝臟、腎臟重量未發(fā)生明顯改變。胸腺重量減輕明顯（P＜0.01），實脾消水乳膏組小鼠胸腺重量增加（P＜0.01）。

3.3 各組小鼠血液學參數(shù)

表2 示，與正常組相比，H22 肝癌腹水瘤小鼠出現(xiàn)紅細胞降低 （P＜0.05）、 血紅蛋白降低 （P＜0.01）、白細胞升高、血小板升高（P＜0.05）和淋巴細胞百分比降低（P＜0.05）。 實脾消水乳膏組能夠提高血紅蛋白，增加淋巴細胞百分比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.4 實脾消水乳膏對腹水瘤小鼠CD4+、CD8+ T淋巴細胞、Treg 細胞的影響

通過對血液中T 細胞亞群分析， 與正常小鼠相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠CD4+T 淋巴細胞比例減少，CD8+T 細胞比例增加，Treg 細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。 實脾消水乳膏能夠增加CD4+T 淋巴細胞比例 （P＜0.05），對CD8+T 淋巴細胞及Treg 細胞有下調的趨勢，但未見顯著性差異（表3）。

3.5 實脾消水乳膏對腹水瘤小鼠血清IL-2、IL-10 表達的影響

表1 小鼠各器官臟器重量（±s，g）

表1 小鼠各器官臟器重量（±s，g）

注： 與正常組比較，* P＜0.05，** P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01。

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表2 各組小鼠血液學參數(shù)的變化（±s）

表2 各組小鼠血液學參數(shù)的變化（±s）

注： 與正常組比較，* P＜0.05，** P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01。

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表3 小鼠CD4+、CD8+ T 淋巴細胞、Treg 細胞的測定（n=6）（±s，%）

表3 小鼠CD4+、CD8+ T 淋巴細胞、Treg 細胞的測定（n=6）（±s，%）

注： 與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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圖5 示，模型組小鼠血清IL-2 表達較對照組小鼠降低 （P＜0.05），IL-10 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。 與模型組比較， 實脾消水乳膏組IL-2水平顯著升高（P＜0.01），IL-10 表達量降低。

4 討論

惡性腹水屬于中醫(yī)“鼓脹”“臌脹”范疇，病機屬本虛標實、虛實夾雜之證，以肺、脾、肝、腎虛為本，濕濁、痰飲、淤血內停為標。故治則當為益氣健脾、溫陽利水、行氣活血。 中醫(yī)藥在惡性腹水的治療方面具有一定療效[6]。實脾消水乳膏是我科專家依“內病外治”理論和“扶正祛邪”治則，據(jù)多年臨證經(jīng)驗研制而成的治療惡性胸腹水的外用乳膏劑。實脾消水乳膏方以黃芪健脾益氣扶正為君藥，桂枝化氣行水、大腹皮行氣寬中，莪術行氣活血為臣藥，牽牛子瀉水消積，紅花活血化瘀，車前子利水滲濕，冰片共為佐藥。經(jīng)過臨床及多中心隨機對照試驗，驗證其能夠減少腹水量，改善腹脹、呼吸困難等癥狀，提高患者生活質量[7，8]。研究[9~12]顯示，黃芪水煎提取物能夠提高淋巴細胞、 單核細胞、CD4+/CD8+比例，升高IL-2 水平，降低CD8+細胞比例，發(fā)揮增強機體免疫功能，增強腫瘤患者T 淋巴細胞亞群、自然殺傷細胞（NK）和巨噬細胞的殺傷力，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

惡性腹水的發(fā)生發(fā)展與機體免疫功能強弱關系密切， 本實驗旨在從免疫調節(jié)角度探究實脾消水乳膏發(fā)揮作用的機制。研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠腹腔注射肝癌細胞后， 小鼠體重于d7 開始迅速增長，腹圍也于d7 開始增長迅速， 提示隨著癌細胞的增殖，腹水開始大量生成。而實脾消水乳膏組小鼠體重及腹圍增長緩慢， 顯示出對惡性腹水的治療作用。對各臟器凈重稱量發(fā)現(xiàn)，各組間心臟、脾臟、肝臟、腎臟凈重未見明顯差異，提示實脾消水乳膏無明顯毒副作用。胸腺和脾臟是機體的免疫器官，其重量一定程度可反映機體免疫功能的強弱。 本實驗觀察到肝癌H22 腹水瘤小鼠胸腺萎縮，實脾消水乳膏給藥組小鼠胸腺重量較模型組增加， 提示此方能增強免疫功能， 對免疫器官萎縮起到一定調節(jié)作用。 其對脾臟免疫器官的調節(jié)作用未觀察到，有待擴大實驗進一步研究。

圖5 對各組小鼠血清IL-2、IL-10 表達的影響

觀察各組小鼠的血象變化， 發(fā)現(xiàn)與正常組相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠出現(xiàn)紅細胞降低、血紅蛋白降低、白細胞升高、血小板升高、淋巴細胞百分比降低。實脾消水乳膏組能夠提高血紅蛋白量，增加淋巴細胞百分比， 提示實脾消水乳膏有補氣生血，增強免疫之功效。

T 細胞是獲得性免疫功能的重要作用細胞。免疫細胞的檢測可反映機體的細胞免疫功能。 成熟T 細胞主要分為CD4+和CD8+亞群。 CD4+細胞是輔助性T 細胞， 主要表現(xiàn)為誘導功能，CD8+細胞是細胞毒性T 細胞，發(fā)揮免疫抑制功能，抑制免疫應答。 生理情況下，機體的CD4+細胞和CD8+細胞按一定比例保持平衡，維持機體免疫功能正常。CD4+/CD8+值降低反映機體免疫功能降低，疾病預后差。 研究顯示在腫瘤狀態(tài)下，CD3+、CD4+細胞計數(shù)及CD4+/CD8+比值均顯著低于健康人群， 提示腫瘤細胞抑制CD4+細胞誘導的細胞免疫及體液免疫[13]。 與以往研究一致，本研究亦在肝癌腹水瘤小鼠發(fā)現(xiàn)CD4+細胞減少、CD8+細胞增加等免疫功能被抑制的表現(xiàn)， 實脾消水乳膏能夠增加CD4+T淋巴細胞數(shù)目，增強機體細胞免疫。

Treg 是一類具有免疫抑制功能的T 細胞亞群，在維持機體免疫平衡中發(fā)揮重要作用，其能夠分泌細胞IL-10、TGF-β 等細胞因子維持免疫耐受，可導致腫瘤細胞免疫逃逸[14]。 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤機體外周血及腫瘤微環(huán)境中Treg 比例增加，且與預后呈負相關[15，16]。 本研究亦發(fā)現(xiàn)H22 肝癌腹水小鼠血液中Treg 百分比增加，然而未發(fā)現(xiàn)實脾消水乳膏對其有明顯的調節(jié)作用。

細胞因子是機體免疫細胞發(fā)揮免疫功能的主要介質，IL-2 是機體重要的免疫應答因子， 是最強有力的T 細胞生長因子。 IL-10 由Treg 等細胞產生，發(fā)揮免疫抑制功能。 本實驗觀察到H22 肝癌腹水瘤小鼠IL-2 表達降低，IL-10 水平增高，實脾消水乳膏能夠升高IL-2 表達水平。

綜上所述， 實脾消水乳膏能夠減少肝癌H22腹水小鼠的腹水量，對肝癌H22 腹水瘤小鼠的免疫功能具有正向調節(jié)作用。