羅 虹，劉凱麗，王 艷

(山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619)

藥對是臨床常用的兩味藥物的配對形式，能起到協(xié)同作用，或增強藥性，或相互制約、緩解毒性[1]。遠志與石菖蒲伍用，名曰遠志湯，出自《圣濟總錄》，可治久心痛。遠志芳香清冽、辛溫行散、寧心安神、散郁化痰；石菖蒲辛散溫通、利氣通竅、辟濁化濕、理氣化痰、活血止痛。遠志通于腎、交于心，石菖蒲開竅啟閉寧神。二藥伍用，可通心竅、交心腎、益腎健腦聰智，開竅啟閉寧神之力增強[2]。

遠志為遠志科植物遠志(polygalatenuifoliawilld.)或卵葉遠志(polygalasibiricaL.)的干燥根，主要含有三萜皂苷、糖酯類化合物以及香豆素、木質素、黃酮、生物堿等成分[3]。遠志味苦、辛，性微溫，歸心、腎、肺經，具有寧心安神、祛痰開竅、消散癰腫的功效，主治驚悸、失眠健忘、癲癇發(fā)狂、咳嗽痰多、癰疽瘡毒、乳房腫痛等[4]。《名醫(yī)別錄》中云遠志：“定心氣，止驚悸，益精，去心下膈氣，皮膚中熱，面目黃。”其臨床功效主要為“寧心安神、祛痰開竅、消散癰腫”[4]。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖，含揮發(fā)油0.11%～0.42%，包括為β-細辛醚、α-細辛醚、石竹烯、α-葎草烯、石菖醚、細辛醚等，尚含有氨基酸、有機酸和糖類等其他成分[5-6]。石菖蒲性溫，味辛、苦，歸心、胃經，具有開竅醒神、化濕開胃、寧心安神的功效，主治脘痞不饑、噤口下痢、神魂癲癇、健忘耳聾[5-6]?！端幮哉摗吩疲骸爸物L濕頑痹，耳鳴，頭風，淚下，殺諸蟲，治惡瘡疥瘙?！薄渡褶r本草經》云：“主風寒濕痹，咳逆上氣，開心孔，補五臟，通九竅，明耳目，出音聲。”

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種漸進性的中樞神經系統(tǒng)的退行性變性病，主要表現(xiàn)為認知功能障礙、日常生活能力下降和精神行為異常[7]。中醫(yī)學文獻中沒有阿爾茨海默病這一病名，相關臨床表現(xiàn)的大量論述散見于癡呆、呆病、善忘、文癡、神呆、郁證等疾病的論述中[8]。皇甫謐在《針灸甲乙經》中以“呆癡”命名，虞摶《醫(yī)學正傳》謂之“愚癡”，《資生經》名曰“癡證”，癡呆病名首見于漢代《華佗神醫(yī)外傳》，楊繼洲的《針灸大成》則分別以“呆癡”和“癡呆”命名，明代《景岳全書·雜證謨》第一次提出“癡呆”是獨立性疾病[9]。

本研究利用網絡藥理學方法研究遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病的相關機制。網絡藥理學從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復雜網絡模型表達和分析研究對象的藥理學性質，適用于闡釋中藥多成分-多靶點的作用關系[10]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據庫與軟件

TCMSP V2.3.0數(shù)據庫、PubChem數(shù)據庫、SWISS數(shù)據庫、TTD數(shù)據庫、Uniprot Database數(shù)據庫、DAVID V6.8.0數(shù)據庫、Cytoscape V3.7.0軟件及其Bisogenet插件、CytoNCA插件、ClueGO插件。

1.2 遠志與石菖蒲中有效成分篩選

通過TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)數(shù)據庫查找相關文獻，獲取中藥化學成分相關信息，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18[11]作為條件，篩選遠志與石菖蒲中的有效成分。OB為口服藥物吸收至體循環(huán)的速度與程度，反映了藥物生物活性分子類藥性的優(yōu)劣[12]。

1.3 藥物有效成分靶點網絡構建

將上述步驟篩選出的有效成分名稱輸入PubChem數(shù)據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，獲取每一成分的SMILES結構式及2D結構或3D結構，輸入SWISS數(shù)據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得藥物成分靶點，根據probability≥0.7[13]標準進行進一步篩選。

利用Cytoscape3.7.1軟件，將篩選后的遠志與石菖蒲的主要活性成分名稱及其對應靶點數(shù)據導入，生成成分靶點可視化網絡。通過String數(shù)據庫選擇需要的蛋白質相互作用，構建遠志、石菖蒲藥物有效成分靶點PPI網絡。

1.4 阿爾茲海默病相關靶點網絡構建

在TTD數(shù)據庫(https://db.idrblab.org/ttd/)中Search drugs and targets by desease or ICD identifier一欄輸入疾病的英文名稱(Alzheimer disease)獲得疾病一級靶點。在TCMSP數(shù)據庫中選擇Disease name一欄，輸入Alzheimer disease，搜索疾病相關靶點，兩種方法得到的靶點取交集確定為疾病相關的靶點[14]。使用Uniprot Database數(shù)據庫(https://www.uniprot.org/)選擇物種為“human”的靶點，將蛋白名稱和基因名稱進行轉換。

利用Cytoscape軟件將疾病靶點數(shù)據導入Cytoscape得到疾病靶點可視化網絡。通過String數(shù)據庫，輸入基因列表，構建疾病靶點PPI網絡。原則：物種智人(Homo Sapiens)。

1.5 交集網絡構建及生物通路分析

先利用Bisogenet插件分別構建藥物成分靶點PPI網絡和疾病靶點PPI網絡，再采用Cytoscape中的merge工具得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網絡，并用Cytoscape中的CytoNCA插件對該網絡中每個節(jié)點的拓撲參數(shù)進行評估分析，選擇degree值≥2倍中位數(shù)的靶點作為核心靶點，得到一個更細致的交集網絡。使用DAVIAD數(shù)據庫對核心靶點進行富集分析，選擇GO分析和KEGG分析，得到富集分析通路，進行進一步討論。

2 結果

2.1 遠志及石菖蒲有效成分篩選

按照上述篩選條件得到石菖蒲活性成分4個，從文獻中篩選出石菖蒲活性成分2個，共計6個，分別為木脂素類、黃酮醇類、揮發(fā)油等成分。遠志活性成分6個[15-16]，為皂苷類、甾醇類等成分。兩藥共篩選得到12個活性成分(如表1)，獲取180個靶點蛋白，根據probability≥0.7[13]篩選得到靶點共44個。

表1 遠志-石菖蒲藥對中的12個活性成分

2.2 遠志-石菖蒲有效成分靶點PPI網絡

將篩選出的12個活性成分及其對應靶點相連構建成分靶點PPI網絡，見圖1。40個靶點中，除2個靶點沒有產生交互關系，其余38個節(jié)點均有交互關系，產生68條邊，degree(節(jié)點通過邊的個數(shù))平均值為3.58，平均聚類系數(shù)為0.441，P-value<0.01。

圖1成分靶點PPI網絡

2.3 阿爾茲海默病靶點PPI網絡

在 TTD數(shù)據庫中與阿爾茨海默病有關的一級靶點共95個，在TCMSP數(shù)據庫中與阿爾茨海默病相關的靶點有30個，對兩種方法得到的靶點取交集，共得到14個阿爾茨海默病一級靶點，見表2。構建疾病靶點PPI網絡如圖2所示，14個靶點中有1個沒有參與蛋白相互作用，13個靶點有蛋白相互作用。網絡圖包括13個節(jié)點，31條邊，節(jié)點度degree平均值為4.43，平均聚類系數(shù)為0.492，P-value<0.01。

表2 阿爾茨海默病靶點

圖2疾病靶點PPI網絡

2.4 遠志-石菖蒲有效成分靶點與阿爾茨海默病靶點交集網絡

采用Cytoscape中的merge工具得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網絡，共287個節(jié)點。根據數(shù)據顯示該交集網絡的degree中位值為11，設定篩選范圍為degree值≥22，共76個節(jié)點，構建PPI網絡，見圖3。其中有兩個靶點沒有產生互交，74個靶點產生363條互交關系，節(jié)點度degree的平均值為9.55，平均聚類系數(shù)為0.553，P-value<0.01。

2.5 生物通路分析結果

將交集網絡核心靶點的基因鍵入DAVID數(shù)據庫中進行KEGG分析和GO分析。KEGG分析共導出通路74條，GO分析共導出263條，選擇P<0.01[11]的通路，再按照相關性排序，結合文獻篩選得到KEGG通路5條(見表3)，GO通路2條(表4)。KEGG分析結果顯示，PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、雌激素信號通路可能是遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病的相關信號通路。GO分析結果顯示，beta-catenin-TCF復合物組裝、MAPK級聯(lián)(MARK cascade)等通路與遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病有關。

圖3成分靶點與疾病靶點交集PPI網絡

表3 KEGG分析結果

表4 GO分析結果

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法，構建遠志-石菖蒲成分靶點及阿爾茨海默病相關靶點網絡，對分子水平上揭示遠志-石菖蒲治療阿爾茨海默病的機制進行探索。通過藥物化學成分分析，得到遠志-石菖蒲藥對主要有效成分12個。藥物有效成分靶點與疾病靶點交集圖印證了遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病涉及多個活性成分、靶標以及通路。生物通路分析結果顯示，遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茲海默病的機制與調節(jié)PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、雌激素信號通路等有關。

PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶)信號通路是維持細胞正常生理功能的重要信號轉導途徑，可以調節(jié)細胞分裂、分化、遷移、骨架重排等生理過程，同時具有肯定的抗凋亡效應[17]。 PI3K-Akt信號通路與阿爾茨海默病的發(fā)生與發(fā)展具有一定的聯(lián)系，通過改變PI3K-Akt信號通路表達可以實現(xiàn)對阿爾茨海默病發(fā)病機制的調節(jié)[18]。PI3K被細胞外信號活化后，可激活下游蛋白激酶Akt。在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中，凋亡相關基因Bad、GSK-3、轉錄因子家族、caspases家族等參與了神經元的凋亡，導致神經元的大量丟失，而活化的Akt通過磷酸化Bad、GSK-3、轉錄因子家族、IB、caspases等使促凋亡基因失活，從而起到抑制神經元凋亡及促進神經元存活的作用，進而減少阿爾茨海默病神經元的大量丟失，改善阿爾茨海默病的病理變化[19]。激活PI3K-Akt信號通路可促進Bcl-2表達，緩解HIBI引起的神經元凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用[20-21]。

ErbB信號不足與神經退行性疾病的進展有關，如阿爾茨海默病[22]。有證據表明，NRG/ERbB信號在大腦中存在一個最優(yōu)水平，偏離這一水平會損害大腦功能[23]。阿爾茨海默病中的突觸丟失、膠質增生、炎癥和神經元死亡等病理變化與神經調節(jié)蛋白-1(NRG-1)及其受體erbB2、erbB3和erbB4的表達改變有關[24]。

在雌激素信號通路中，雌激素激活雌激素受體ER和GPR30。阿爾茨海默癥患者中有2/3為女性，該病女性患病率高與絕經期間卵巢性激素的喪失有關[25]。阿爾茨海默患者大腦白質中雌激素受體β顯著減少[26]，雌激素受體β的作用之一在于降低阿爾茨海默病大鼠海馬體中的炎癥反應水平和β淀粉樣蛋白沉積程度，并提高學習和記憶能力[27]。

MAPK信號通路是細胞內的一條蛋白質鏈，其將細胞表面受體的信號傳遞給細胞核內的DNA，非正常MAPK級聯(lián)的功能與癌癥、糖尿病、自身免疫性疾病和發(fā)育異常等疾病的誘導和發(fā)展有關[28]。

4 結論

網絡藥理學分析結果表明，遠志-石菖蒲藥對中的有效成分治療阿爾茨海默病可能通過PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、雌激素信號通路等發(fā)揮作用。本研究為該藥對健腦作用的相關機制提出了預測，為其進一步研究奠定了基礎。