孟春梅，王開勇，樊 華，張開祥，馬宏秀

棉粕對鹽堿環(huán)境下土壤微生物多樣性及土壤結(jié)構(gòu)的影響①

孟春梅，王開勇*，樊 華，張開祥，馬宏秀

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000)

以棉粕作為鹽堿土改良劑，針對不同程度的鹽堿土壤為研究材料，探究棉粕對鹽堿環(huán)境下微生物多樣性及土壤結(jié)構(gòu)的影響。提取土樣中微生物總DNA，利用新一代illumina HiSeq高通量測序技術(shù)進行相關(guān)分析，對于土壤微形態(tài)則利用掃描電鏡進行觀察。結(jié)果表明，隨著鹽堿濃度的提高，氯化鈉處理下小團聚體所占比例逐步上升且土壤形態(tài)表現(xiàn)為表面疏松多孔；碳酸鈉則相反，其大團聚體隨堿濃度提高而增加，小團聚體所占比例則下降，土壤形態(tài)則呈現(xiàn)表面緊實，孔隙少，鹽堿土的這兩種土壤結(jié)構(gòu)都不利于微生物的生存活動。通過對土壤樣品中微生物多樣性分析得出，添加棉粕的所有處理相比CK(常規(guī)施肥)可以增加鹽堿土中微生物群落數(shù)量，其中中度鹽(MN)、中度堿(MA)處理Shannon指數(shù)最大，Simpson 指數(shù)最小，說明添加棉粕后MN、MA處理的微生物豐富度最高，鹽堿處理下土壤中主要的微生物群落包括 10個門，其中變形菌門占主導(dǎo)地位，其余依次是放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門、浮霉菌門、疣微菌門、厚壁菌門?？傮w而言，通過向鹽堿土中添加棉粕可以相應(yīng)地改善土壤結(jié)構(gòu)，一定程度上增加其微生物群落數(shù)量，在中度鹽堿情況下添加棉粕使其土壤中微生物豐度最高，而鹽堿這種特定的土壤環(huán)境中微生物占優(yōu)勢菌門沒有太大差異。

鹽堿土；微生物多樣性；土壤結(jié)構(gòu)

新疆鹽堿地面積分布廣、種類多，是最大的農(nóng)業(yè)可開發(fā)后備土地資源[1]，但由于鹽堿地土壤結(jié)構(gòu)差不利于農(nóng)作物生長，其中微生物種類數(shù)量也因不同鹽堿地種類而有所差異，所以在鹽堿土壤改良過程中，鹽堿土土壤結(jié)構(gòu)及微生物多樣性成為了很多研究者的關(guān)注重點。棉粕在新疆的產(chǎn)出量隨棉花產(chǎn)量增加而增加[2]，由于其存在的毒害物質(zhì)限制了其利用[3-5]，但作為一種新的鹽堿土改良劑，其養(yǎng)分種類多，可以為鹽堿土壤提供有機物質(zhì)和作物需要的相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，改善土壤結(jié)構(gòu)，從而改善土壤中微生物的生存環(huán)境。

微生物是土壤中不可缺少的部分，種類繁多、數(shù)量龐大，在特定或環(huán)境惡劣的土壤中存在特定的微生物[6]。土壤鹽堿化使得微生物生境發(fā)生改變，生存活動受到脅迫，從而使得該土壤環(huán)境下的微生物種類、數(shù)量、生理功能及遺傳特性不同于其他正常類型土壤中的微生物狀況。微生物通過分泌的代謝物或菌根菌絲對土壤直接進行團聚作用或者物理纏繞從而影響土壤團聚結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定，進而，土壤團聚結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化又間接表明了土壤微生物活動狀況，而且微生物是有機質(zhì)膠結(jié)土壤團聚體的重要催化劑和原動力[7]。這些微生物的代謝活動決定了土壤物理性狀及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[8]。所以進一步研究分析棉粕改良鹽堿土土壤中微生物的分布及多樣性的研究，有利于更好地利用鹽堿土，調(diào)節(jié)微生物活性及數(shù)量，從而更有效地把鹽堿土逐步地轉(zhuǎn)變?yōu)榭衫猛寥馈?/p>

隨著現(xiàn)代科技技術(shù)的突飛猛進，微生物多樣性檢測技術(shù)越來越多樣化、精準(zhǔn)化、方便化，本文利用棉粕探究鹽堿土中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，采用現(xiàn)今最為普遍的新一代高通量測序技術(shù)[9-11]來分析鹽堿土壤條件下微生物多樣性，以此充分了解該研究區(qū)域內(nèi)鹽堿土壤內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性以及優(yōu)勢種，便于今后的鹽堿土壤微生物的研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

2016年試驗于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗站內(nèi)進行(86°08′ 20.72′′E，44°18′ 42.37′′N)，海拔高度450.8 m，年平均氣溫 6.5 ~ 7.2 ℃，全年日照時數(shù) 2 721 ~ 2 818 h，無霜期147 ~ 191 d，年降雨量 125.0 ~ 207.7 mm，年蒸發(fā)量 1 000 ~ 1 500 mm，屬溫帶大陸性氣候。試驗土壤類型為灌溉灰漠土，質(zhì)地重壤。所使用改良材料棉粕的常規(guī)養(yǎng)分含量[12]為：干物質(zhì) 900 g/kg、粗纖維105 g/kg、無氮浸出物289 g/kg、粗灰分6.0 g/kg，磷、有效磷、鉀、鎂分別為10.4、2.06、11.6、4.0 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

供試作物為棉花，在試驗的前一年用NaCl和Na2CO3鹽對試驗區(qū)土壤預(yù)先進行鹽化處理，共設(shè)置7個處理(表1)，棉花播種前一個月將棉粕均勻撒施于土壤中并進行翻埋，提前腐熟。試驗小區(qū)面積5 m2，小區(qū)間距1.5 m，每個處理重復(fù)3次，共21個小區(qū)。試驗采用滴灌模式，一膜兩管四行，配置模式40+20+40，膜距40 cm，行距20 cm。氮、磷、鉀肥按照20︰9︰18于播種前作基肥一次性施入。4月30日播種，10月2日收獲。

表1 試驗設(shè)置

1.3 樣品采集

于棉花收獲期分別采集0 ~ 20 cm耕層原狀土樣，每個小區(qū)采3點混合，分成兩份，一份置于自封袋中并置于冰盒中，及時帶回實驗室置于零下80 ℃超低溫冰箱中用于微生物多樣性檢測；一份置于塑料盒中，帶回室內(nèi)自然風(fēng)干，用于土壤結(jié)構(gòu)組成及掃描電鏡測定。在取土和運輸過程中盡量減少對土樣不必要的搬動，以免破壞土壤團聚體。室內(nèi)沿自然紋路掰成小土塊，除去新生體和動植物殘體后自然風(fēng)干[13]，然后采用干篩法分離出5 ~ 2 mm、2 ~ 0.25 mm、< 0.25 mm共3級團聚體。

1.4 測定指標(biāo)及方法

土壤微生物多樣性：基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對 Reads 拼接過濾，OTUs(operational taxonomic units)聚類，并進行物種注釋及豐度分析。

土壤機械結(jié)構(gòu)組成及形態(tài)觀察：干篩法[14]，掃描電鏡[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕對不同鹽堿土壤結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)團聚體形成膠結(jié)劑的種類，可將團聚體分為大團聚體(>250 μm)和微團聚體(<250 μm)[16]。而在土壤團聚體形成的過程中，不同粒級的團聚體形成因素也有所不同，如很多微小團聚體由植物根系分泌物或土壤微生物活動及代謝產(chǎn)物的膠結(jié)逐步形成較大團聚體，其次，微團聚體則主要通過有機物質(zhì)的膠結(jié)形成，而大團聚體主要通過菌根網(wǎng)絡(luò)和植物根系的纏繞作用形成[17]。

由表2可知隨著氯化鈉濃度的提高，鹽處理下小粒徑(<0.25 mm)土壤比例呈上升趨勢。且由圖1土壤SEM圖像(1 000倍)可以看出，添加棉粕的處理相比CK，土壤疏松多孔、表面粘附有較多粘結(jié)物質(zhì)，進而形成相應(yīng)土壤結(jié)構(gòu)，其可能是由植物根系及微生物分泌物的作用下形成微小的土壤結(jié)構(gòu)，這些微小結(jié)構(gòu)又由有機質(zhì)膠結(jié)為微團聚體。但在堿處理下，隨著碳酸鈉濃度的提高，小粒徑土壤比例呈下降趨勢，大粒徑(2.00 ~ 5.00 mm)土壤比例呈上升趨勢，表明在植物根系或菌絲的作用下，土壤結(jié)構(gòu)向大團聚體方向轉(zhuǎn)變，再加上碳酸鈉性質(zhì)上的影響，土壤會板結(jié)，致使微生物的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于碳酸鈉對土壤的影響，由電鏡掃描圖像也可看出這種趨勢。由表3可知隨著鹽堿濃度的提高，總體上土壤pH、EC值也隨之提高，但是氯化鈉處理的pH低于碳酸鈉處理，EC值高于碳酸鈉處理，體現(xiàn)出氯化鈉與碳酸鈉處理下土壤性質(zhì)有著明顯的不同，這也導(dǎo)致兩種處理下土壤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同的性狀。而這鹽堿處理下土壤結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變都是將土壤結(jié)構(gòu)向不利于作物生長的土壤環(huán)境方向進行，即使在棉粕這種有機物質(zhì)及微生物活動和分泌物的膠結(jié)作用下可使土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但是其膠結(jié)作用弱于氯化鈉對于土壤的分散作用及碳酸鈉對土壤的凝結(jié)，對于MN、MA處理的土壤結(jié)構(gòu)在棉粕的作用下相比于LN、LA和HN、HA處理呈現(xiàn)較好土壤結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

表2 0 ~ 20 cm土層各粒級所占百分比(%)

注：表中大寫字母不同表示同一處理不同粒徑土壤百分比差異達<0.05 顯著水平，小寫字母不同表示同一粒徑土壤百分比在不同處理間差異達<0.05 顯著水平。

(A、B、C、D、E、F、G分別表示CK、LN、MN、HN、LA、MA、HA處理)

表3 土壤pH、EC值

注：表中同行數(shù)據(jù)小寫字母不同表示處理間差異達到<0.05 顯著水平。

2.2 土壤生物信息學(xué)分析

土壤環(huán)境決定了土壤中微生物的生存環(huán)境及可利用的資源，土壤環(huán)境及結(jié)構(gòu)越利于作物的生長就越有利于微生物的生長代謝[18]，所以微生物的種類及數(shù)量也可以反映一個區(qū)域內(nèi)土壤環(huán)境的好壞及開發(fā)利用方向。

2.2.1 土壤微生物多樣性分析 OTU 即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系、種、屬、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。根據(jù)不同的相似度水平，對所有序列進行 OTU 劃分，一般情況下，如果序列之間的相似性高于97% 就可以把它定義為一個 OTU，每個 OTU 對應(yīng)于一種代表序列。由表4可知，7個處理總的分類單元數(shù)為2 234個，均高于單個處理下的OTU數(shù)，說明在每個處理下都有不同于其他處理的OTU分類單元，其中可以看出添加棉粕下的鹽堿處理相對于CK可使OTU數(shù)提高8 ~ 14個，使其微生物多樣性有所增加，說明添加棉粕可以使得鹽堿環(huán)境下的土壤環(huán)境向有利于微生物生存活動的方向轉(zhuǎn)變，但在高濃度的鹽堿處理下相對于中等濃度鹽堿處理的OTU數(shù)少2 ~ 6個。

結(jié)合Alpha多樣性分析并通過物種累積曲線、多樣性曲線和統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)中的均值、離散程度、最大值、最小值、異常值來評估單樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性差異。表4所示，Chaol和 ACE 指數(shù)可以看出，HN處理和MA處理Chaol和 ACE指數(shù)相對較高，說明群落豐度較高，CK處理的群落豐富度較低，總體上體現(xiàn)在添加棉粕后都可使鹽堿處理的群落豐富度有所增加。從 Simpson 和 Shannon 指數(shù)可以看出，試驗組的群落多樣性變化規(guī)律不明顯，無法結(jié)合兩種指數(shù)對群落多樣性進行準(zhǔn)確分析，但是，總體上可以看出在MN、MA處理下物種的多樣性較高。

表4 多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

2.2.2 土壤細(xì)菌群落組成 如圖2所示，選定相對豐度高于0.1% 的細(xì)菌類群制作多樣品物種分布圖，從圖中可以看出，不同處理樣品中在門水平上主要包括酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinoba-cteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門和其他一些未能分類鑒定的微生物類群。不同試驗組中優(yōu)勢類群主要為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門。由表5中可看出放線菌門在CK中比其他處理都高，最高可高出3%，說明鹽堿處理下不利于放線菌門的生長繁殖，但是對于變形菌門和芽單胞菌門其所占比例普遍高于CK，MN和MA處理下變形菌門相對于CK處理所增幅度可達3% 和2%，其中在氯化鈉處理下放線菌、芽單胞菌、變形菌所占比例高于碳酸鈉處理下，酸桿菌則相反。

圖2 不同處理門水平上細(xì)菌群落組成

表5 不同處理土壤微生物優(yōu)勢類群(%)

2.2.3 物種豐度聚類熱圖 如圖3所示，基于 OTU 結(jié)果用不同顏色變化來表示不同樣品在科水平上的群落組成相似性，圖中所表示的是不同處理下科水平熱圖聚類情況。從圖中可以看出，HA處理和LA處理的相似性較近，聚為一類，CK、MN、HN及LN可聚為一類。MA處理位于較遠(yuǎn)的聚類分支上，且MA處理與其他組在顏色分布上相差較大，從而可以看出鹽處理下和堿處理下的微生物聚集情況不相似。

圖3 各水平物種豐度聚類熱圖

3 討論

土壤鹽堿化影響微生物種類、數(shù)量及活動代謝狀況，反之微生物活動代謝又可以利于土壤結(jié)構(gòu)的改善，利于植被的生長[19]。土壤團聚的形成與有機質(zhì)及微生物緊密聯(lián)系著，微生物并且也是其形成過程中最為活躍的生物因素[20]，通過外源向土壤添加有機質(zhì)也可以改變土壤團聚體組成，王雙磊等[2研究發(fā)現(xiàn)用棉花秸稈還田可使小團聚體向大團聚體轉(zhuǎn)變，使小團聚體含量減少大團聚體增加，該趨勢與碳酸鈉處理中土壤團聚體變化一致，氯化鈉處理則表現(xiàn)出小團聚體相對空白處理來說有明顯的增加，其原因可能是氯化鈉本身施入土壤后對土壤表現(xiàn)出較強的分散作用，以至于棉粕對氯化鈉處理下土壤團聚作用弱于其分散作用。王清奎等[22]認(rèn)為土壤團聚體的形成過程中，微生物除了分泌多糖類膠結(jié)物質(zhì)使微團聚體進行粘結(jié)，還會通過菌絲進行物理纏繞將大團聚體進行粘結(jié)，但是微生物持續(xù)性的分解土壤有機質(zhì)會對已經(jīng)形成的土壤結(jié)構(gòu)造成破壞[23]，本研究中棉粕作為有機質(zhì)施入鹽堿土壤中，為其增加了膠結(jié)物質(zhì)也為微生物提供了生存物質(zhì)，使得處理下的土壤結(jié)構(gòu)在微生物及有機質(zhì)的協(xié)助下得到相應(yīng)優(yōu)化，相反也為微生物營造了適合其生存的土壤結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出不同的微生物多樣性。

土壤微生物數(shù)量及種類都非常之龐大，不同環(huán)境中的微生物表現(xiàn)出的功能也不盡相同，自然環(huán)境相比人類影響下具有特有的微生物群落[24]，其環(huán)境中的優(yōu)勢種也有所差異。鄭賀云等[25]以新疆阿克蘇地區(qū)52個鹽堿土樣為研究對象發(fā)現(xiàn)，新疆鹽堿地中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富，并發(fā)現(xiàn)了21 個優(yōu)勢菌屬，包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬等，表明鹽堿土中微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子是緊密相關(guān)的。牛世全等[8]研究發(fā)現(xiàn)河西走廊鹽堿土中變形菌門為原生鹽堿土和農(nóng)田土中的優(yōu)勢菌門，放線菌門是次生鹽堿土中的優(yōu)勢菌門且分布的細(xì)菌多嗜鹽堿細(xì)菌，而原生鹽堿土中的微生物多樣性最低，但優(yōu)勢菌屬較次生鹽堿土和農(nóng)田土多。Canfora等[26]以意大利西西里島不同鹽濃度的鹽堿土作為微生物多樣性研究對象，發(fā)現(xiàn)占優(yōu)勢的菌門包括變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門和厚壁菌門，其中變形菌門種群所占比例最大高達95.5%，其次就是放線菌門占83.39%。李新等[27]以不同鹽堿程度鹽堿土作為研究對象發(fā)現(xiàn)，土壤鹽堿化程度越低，土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度越高，其中變形菌(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群。這一系列研究發(fā)現(xiàn)的占優(yōu)勢菌與本文研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，這說明在鹽堿這種特定的鹽堿化土壤條件下微生物類群分布具有相似性，且放線菌門與變形菌門是鹽堿土中最為普遍的兩種[28-29]。

4 結(jié)論

1)在棉粕這種有機物質(zhì)及微生物活動的膠結(jié)作用下可使土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其氯化鈉處理下隨鹽分的增加小團聚由于植物與微生物分泌物及有機質(zhì)的作用所占比例呈上升趨勢，而碳酸鈉處理則相反，但是其膠結(jié)作用弱于氯化鈉對于土壤的分散作用及碳酸鈉對土壤的凝結(jié)作用，對于中度鹽堿處理下的土壤結(jié)構(gòu)在棉粕的作用下相比于低鹽堿和高濃度鹽堿呈現(xiàn)最好土壤結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

2)通過土壤生物信息學(xué)分析可知，向鹽堿土中添加棉粕改良劑可以增加土壤中微生物種群數(shù)量，鹽堿條件下土壤中占優(yōu)勢的菌門有酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、變形菌門，其中變形菌門種群所占比例最大達36%，氯化鈉處理下放線菌、芽單胞菌、變形菌所占比例高于碳酸鈉處理下，酸桿菌則相反。

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Effects of Cottonseed on Soil Microbial Diversity and Soil Structure Under Saline-alkali Environment

MENG Chunmei, WANG Kaiyong*, FAN Hua, ZHANG Kaixiang, MA Hongxiu

(College of Agronomy, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Cottonseed meal was taken as the improver of saline-alkali soil with different salinity degrees to study the effects of cottonseed on soil microbial diversity and soil structure. Total DNA of soil samples were extracted and analyzed by a new generation of illumina HiSeq high-throughput sequencing technology, and soil micromorphology was observed by SEM. The results showed that with the increase of salinity and alkalinity, NaCl increased the proportion of micro aggregates gradually and made soil surface looser and more porous, but NaCO3had the contrary effects, both such soil structures are not conducive to microbial activity. Cottonseed addition could increase the number of microbial communities in saline-alkali soil compared with conventional fertilization, the highest Shannon's index and the lowest Simpson's index for saline-alkali soil were obtained under medium saline-alkali concentration, which indicated that microbial richness was the highest with cottonseed addition. The microbial community under Saline treatment includes 10 phylums, of which the dominant is Proteobacteria, followed by Actinomyces, Acid Bacillus, Bacillus monilia, Green Bending bacteria, Bacteroidetes, Nitrosospiro, Wartericobacter, Firmicutes. In general, cottonseed addition to saline-alkali soil can improve the soil structure and increase the number of microbial communities to a certain extent. Adding cottonseed under moderate saline-alkali condition results in the highest microbial abundance in the soil, but there is no obvious difference in the predominant microbial phylum in saline-alkali soil.

Saline-alkali soil; Microbial diversity; Soil structure

S-3

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.01.030

孟春梅, 王開勇, 樊華, 等. 棉粕對鹽堿環(huán)境下土壤微生物多樣性及土壤結(jié)構(gòu)的影響. 土壤, 2020, 52(1): 207–212.

國家自然科學(xué)基金項目(31560169，31860591)、國家重點研發(fā)項目(2016YFC0501406)、國家國際科技合作專項(2015DFA11660)和石河子大學(xué)項目(GJHZ201802，ZZZC201619)資助。

孟春梅(1995—)，女，新疆阿克蘇人，碩士研究生，主要從事土壤環(huán)境與生態(tài)安全研究。E-mail: 253531987@qq.com