張立， 普布次仁， 胡亞東， 扎西， 洛桑催成， 次仁曲珍， 德慶卓嘎

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩850009； 2. 中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041)

家養(yǎng)綿羊Ovisaries屬于鯨偶蹄目Cetartioda ctyla反芻亞目Ruminantia?？艬oridae綿羊?qū)貽vis，作為主要家畜在人類的經(jīng)濟生活中占據(jù)著重要地位，經(jīng)過人工選育出現(xiàn)了不同的品種(張立嶺，2004)。綿羊的繁殖力極大地影響著綿羊養(yǎng)殖的經(jīng)濟性，對綿羊繁殖力進(jìn)行研究是提升中國綿羊生產(chǎn)水平的必由之路(呂曉曼等，2012)。每胎產(chǎn)羔數(shù)是影響綿羊繁殖力的重要因素，提高綿羊的每胎產(chǎn)羔數(shù)可在短期內(nèi)較大地增加綿羊養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，因此，綿羊的產(chǎn)羔性狀研究一直受到人們的重視(楊廣禮，羅玉柱，2004)。發(fā)現(xiàn)和利用綿羊多羔性狀相關(guān)遺傳資源，闡明綿羊多羔性狀形成的分子調(diào)控機理，篩選和鑒定綿羊多羔性狀相關(guān)基因，逐漸成為綿羊多羔研究中的熱點問題，有利于人們從遺傳角度理解和利用綿羊的多羔性狀(付紹印等，2017)。畜牧業(yè)是青藏高原地區(qū)重要的經(jīng)濟支柱型產(chǎn)業(yè)，其中綿羊畜牧業(yè)占據(jù)著舉足輕重的地位。彭波半細(xì)毛羊是西藏自治區(qū)選育的家養(yǎng)綿羊新品種，也是西藏第一個國家級家畜新品種，目前在西藏地區(qū)大量養(yǎng)殖，具有極為重要的經(jīng)濟價值(央金，2012)。自然條件下彭波半細(xì)毛羊每胎以產(chǎn)單羔為主，偶有產(chǎn)雙羔現(xiàn)象。目前雖已發(fā)現(xiàn)MMPR-1B、GDF9、BMP15等基因的突變與特定品種綿羊的產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)，但彭波半細(xì)毛羊之前的研究未發(fā)現(xiàn)此類基因與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性(Yanetal.，2001；Chongetal.，2019；穆方方等，2019；Zhengetal.，2019)。并且，研究也證實綿羊的產(chǎn)多羔性狀是一個低遺傳性狀，每胎產(chǎn)羔數(shù)受品種、飼養(yǎng)、年齡、遺傳等多因素影響(Tangetal.，2019)。因此，彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔的機理需要從更全面的角度進(jìn)行研究。

綿羊產(chǎn)多羔現(xiàn)象與其卵巢卵泡發(fā)育及排卵數(shù)等因素直接相關(guān)(付紹印等，2017)，對產(chǎn)雙羔彭波半細(xì)毛羊的卵巢特異表達(dá)基因進(jìn)行研究，有利于更好地理解產(chǎn)雙羔彭波半細(xì)毛羊的分子特異調(diào)控機制，也有可能找到與其產(chǎn)雙羔性狀相關(guān)的候選基因并加以利用，從而促進(jìn)彭波半細(xì)毛羊的人工快速繁育工作。到目前為止，有關(guān)彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔相關(guān)基因的研究還極為缺乏。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)對彭波半細(xì)毛羊發(fā)情期的卵巢特異表達(dá)基因進(jìn)行了研究，重點關(guān)注產(chǎn)雙羔彭波半細(xì)毛羊卵巢的基因特異表達(dá)模式，分析和篩選了可能對彭波半細(xì)毛羊卵泡發(fā)育和排卵數(shù)產(chǎn)生影響的特異表達(dá)基因。相關(guān)研究結(jié)果不僅有利于人們加深對彭波半細(xì)毛羊這一高原藏綿羊品種產(chǎn)雙羔機理的理解，也有利于產(chǎn)雙羔候選基因的篩選利用研究工作。

1 材料與方法

1.1 材料

彭波半細(xì)毛羊養(yǎng)殖于西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所位于西藏自治區(qū)拉薩市林周縣的良種養(yǎng)殖基地，選取年齡3～4歲且有2次連續(xù)產(chǎn)雙羔記錄的母羊3只，為雙羔組；選取年齡3～4歲且有2次連續(xù)產(chǎn)單羔記錄的母羊3只，為單羔組。各組綿羊體質(zhì)量相近，健康狀況良好。

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵巢總RNA的提取制備及測序文庫構(gòu)建雙羔組及單羔組綿羊于養(yǎng)殖基地現(xiàn)場屠宰，快速分離出卵巢，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后置于干冰中冷凍保存及運輸。實驗室超凈工作臺中將卵巢于液氮中研磨粉碎，之后使用Trizol進(jìn)行卵巢組織總RNA的提取。總RNA質(zhì)量檢測合格后，每個樣品取3 μg總RNA使用Illumina的NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。通過Oligo(dT)磁珠富集mRNA，將mRNA隨機打斷片段化后以隨機寡核苷酸為引物合成cDNA，并使用RNaseH降解RNA鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭后進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后得到文庫。文庫構(gòu)建完成后，使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進(jìn)行質(zhì)量檢測(楊永剛等，2019)。

1.2.2 文庫測序和差異基因表達(dá)分析不同文庫分別采用Illumina Hiseq平臺進(jìn)行測序，測得的序列數(shù)據(jù)(reads)經(jīng)過濾后得到clean reads。使用NCBI數(shù)據(jù)庫中Ovisaries基因組數(shù)據(jù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Ovis+aries)作為參考基因組，利用HISAT2(2.0.5)將配對末端clean reads與參考基因組進(jìn)行比對。采用subread中的featureCounts工具對基因進(jìn)行表達(dá)水平的定量，根據(jù)基因長度計算每個基因的FPKM值。雙羔組和單羔組之間的基因差異表達(dá)分析使用DESeq2R(Loveetal.，2014)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以|log2(FoldChange)|>1和多重假設(shè)檢驗校正后的P值(padj)<0.05為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的熒光定量PCR(qPCR)驗證以雙羔組及單羔組各樣品總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計10個基因的定量PCR引物，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果使用2-△△Ct分析方法進(jìn)行差異表達(dá)量計算。

1.2.4 差異表達(dá)基因的功能分類及代謝通路富集分析差異基因GO功能富集和KEGG通路富集通過clusterProfiler R進(jìn)行，分別基于GO數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org)和KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行富集分析，上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析分別進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因篩選與驗證

各組樣品總RNA提取后，檢測濃度和完整性，合格后進(jìn)行文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序分析。對2組樣品所建文庫進(jìn)行測序，每個樣品的測序量約15 G，測序所得clean reads進(jìn)行基因組比對后，比對率均達(dá)到90%以上。

所測數(shù)據(jù)通過與參考基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對后，共發(fā)現(xiàn)21 509個基因。以|log2(FoldChange)|>1和padj<0.05為篩選閾值，與單羔組相比，雙羔組共有2 489個基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中上調(diào)基因1 021個，下調(diào)基因1 468個。以-log10(padj)為縱坐標(biāo)，log2(FoldChange)為橫坐標(biāo)，繪制雙羔組相對于單羔組的卵巢差異表達(dá)基因分布情況(圖1)，當(dāng)padj=0.05時，-log10(padj)=1.301。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，選取了10個差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗證(表1)，以綿羊beta-actin基因作為內(nèi)參(引物序列5’-3’分別為：GAGCATCCCCAAAGTTCTAC、AATCACCTCCCCTGTGT-G)。與單羔組相比，雙羔組基因NFIC、MAST1、GLB1L3、MYCBPAP、RBMX2的表達(dá)下調(diào)，基因CA5A、SLC7A5、CMTM6、SCD、TMED5的表達(dá)上調(diào)，且基因的差異表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致(圖2)。上述數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄組測序所得到的數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

為了對雙羔組的卵巢差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，本研究首先使用GO數(shù)據(jù)庫對差異基因的功能進(jìn)行了富集分析。GO分析分別從分子功能、細(xì)胞組分、生物過程3個層面對差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能富集(圖3)。如以padj<0.05為顯著性富集的閾值，可發(fā)現(xiàn)部分上調(diào)基因發(fā)生了顯著性的富集。其中，發(fā)生顯著性富集的上調(diào)基因在生物過程層面主要富集于跨膜轉(zhuǎn)運，在細(xì)胞組分層面主要富集于質(zhì)膜蛋白復(fù)合體、質(zhì)膜、質(zhì)膜部分，在分子功能與單羔組相比較Compared with single group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3層面主要富集于跨膜受體蛋白激酶活性(表2)。顯著富集的上調(diào)基因均與細(xì)胞膜及膜相關(guān)功能有關(guān)，表明雙羔組的卵巢細(xì)胞中有較活躍的跨膜運輸或者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的生理活動，而這種生理活動有可能與雙羔組卵巢的卵泡發(fā)育相關(guān)。

圖1 雙羔組與單羔組差異表達(dá)基因分布Fig. 1 Numbers of differentially expressed genes between dual group and single group

表1 差異表達(dá)基因qPCR驗證引物序列Table 1 Primers used for qPCR in this study

圖2 部分差異表達(dá)基因的qPCR結(jié)果
Fig. 2 Relative expression of selected differentially expressed genes as determined by qPCR

以padj<0.05為閾值，雙羔組下調(diào)基因在生物過程層面未發(fā)生顯著性的GO富集，但仍可發(fā)現(xiàn)下調(diào)的基因主要富集于翻譯、物質(zhì)代謝以及細(xì)胞呼吸等生物過程。在細(xì)胞組分層面上，雙羔組下調(diào)基因顯著富集于細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合體和核糖核蛋白復(fù)合體。這預(yù)示著雙羔組卵巢細(xì)胞中核糖核蛋白復(fù)合體有所變化，同時細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝及蛋白翻譯等活動有所減緩。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析有助于更深入了解雙羔組差異表達(dá)基因?qū)β殉舱{(diào)控的影響，差異表達(dá)基因經(jīng)KEGG富集(圖4)：上調(diào)基因多富集于細(xì)胞粘附以及膜相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)基因多富集于產(chǎn)能產(chǎn)熱及物質(zhì)代謝相關(guān)通路，這與GO功能分析的結(jié)果相互印證。

以padj<0.05為閾值，-log10(padj)>1.301時表示發(fā)生了KEGG顯著性富集，-log10(padj)值越大，富集越顯著。雙羔組卵巢上調(diào)基因出現(xiàn)了較顯著的富集(圖4；表3)，下調(diào)基因未見顯著性富集。

圖3 雙羔組差異表達(dá)基因GO富集分析
Fig. 3 GO analysis of differentially expressed genes of dual group

A.上調(diào)基因， B. 下調(diào)基因

A. up-regulated genes， B. down-regulated genes

雙羔組的上調(diào)基因顯著富集于與卵巢內(nèi)細(xì)胞粘附及運動、發(fā)育相關(guān)的通路。其中細(xì)胞粘附分子、粘附斑、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用均與細(xì)胞粘附、細(xì)胞運動直接相關(guān)，而細(xì)胞粘附與運動是貫穿于卵泡發(fā)育及排卵整個過程的生命活動。

另一方面，雙羔組卵巢內(nèi)大量上調(diào)基因顯著富集于TGF-beta、cGMP-PKG、Hippo、cAMP等信號通路中，這些信號通路與細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育、遷移以及激素調(diào)節(jié)等功能有較緊密的關(guān)系(Sandovaletal.，2017；Gasioretal.，2019)，如TGF-beta信號通路可影響動物卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育調(diào)節(jié)過程(Zhengetal.，2008)。

結(jié)合GO和KEGG的富集分析，發(fā)現(xiàn)雙羔組彭波半細(xì)毛羊發(fā)情期內(nèi)卵巢中有大量基因表達(dá)出現(xiàn)顯著性的上調(diào)，上調(diào)基因的功能主要與細(xì)胞膜相關(guān)的生理活動相關(guān)，包括細(xì)胞粘附、運動以及質(zhì)膜相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3 討論

綿羊產(chǎn)雙羔性狀受多方因素影響，但與綿羊卵巢中卵泡的發(fā)育及排卵數(shù)直接相關(guān)。因此，產(chǎn)雙羔或多羔綿羊卵巢的調(diào)控機制研究對于理解其特殊的產(chǎn)雙羔或多羔性狀具有重要的意義。RNA-Seq作為一種高通量差異基因表達(dá)研究方法，可以為相關(guān)研究提供更快速和全面的研究手段(蘭道亮等，2014)。對于綿羊等動物繁殖力的研究，轉(zhuǎn)錄組測序能夠更有效和全面地幫助人們發(fā)掘繁殖性狀相關(guān)的候選基因以及內(nèi)在的分子機制(Miaoetal.，2014)。彭波半細(xì)毛羊作為藏綿羊的代表新品種，其產(chǎn)雙羔性狀可能具有特殊的機理，但目前研究資料極為缺乏，嚴(yán)重阻礙青藏高原地區(qū)特有綿羊品種的快速繁育研究。

綿羊卵巢中，卵泡的發(fā)育實際上是卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞互相調(diào)控的過程，卵泡的形態(tài)和功能也隨著發(fā)育時間而不斷變化(Matikainenetal.，2001；肖國宏，2014)。卵泡的發(fā)育過程由原始卵泡的啟動開始，原始卵泡啟動機制可能與卵泡內(nèi)外分泌的各種因子、神經(jīng)遞質(zhì)或卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞間的信號傳遞等有關(guān)(Kidder & Mhawi，2002)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞因子、白血病抑制因子、神經(jīng)生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素和角化細(xì)胞生長因子等，均能誘導(dǎo)原始卵泡的啟動性募集，從而發(fā)育為成熟卵泡(Nilsson & Skinner，2004；應(yīng)詩家，2012)。卵泡中的卵母細(xì)胞周圍包裹著各種體細(xì)胞，體細(xì)胞合成的相關(guān)激素物質(zhì)會通過卵泡液運送到卵母細(xì)胞中，以調(diào)控和促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟和啟動減數(shù)分裂(Matzuketal.，2002；Wigglesworthetal.，2015)?？梢?，卵泡的發(fā)育及卵子的成熟過程均需要卵泡組織及卵母細(xì)胞膜相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和物質(zhì)跨膜運輸功能的配合，而這些過程均與卵巢內(nèi)各細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)，這預(yù)示著卵巢內(nèi)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)在卵泡發(fā)育及排卵過程中擔(dān)負(fù)著舉足輕重的作用。

圖4 雙羔組差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig. 4 KEGG analysis of differentially expressed genes of dual group

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，雙羔組卵巢組織中的基因在轉(zhuǎn)錄層面出現(xiàn)明顯的差異。GO分析發(fā)現(xiàn)雙羔組的卵巢組織細(xì)胞中有較活躍的跨膜運輸?shù)饶そY(jié)構(gòu)相關(guān)的生理活動，KEGG富集分析則發(fā)現(xiàn)雙羔組卵巢中的細(xì)胞粘附、細(xì)胞運動以及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)生理活動顯著增強，而細(xì)胞粘附、運動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路的實現(xiàn)則離不開細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運輸以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)?？紤]到綿羊等哺乳動物卵泡發(fā)育以及排卵的特點，雙羔組卵巢組織中細(xì)胞膜相關(guān)生理活動的活躍，預(yù)示著雙羔組卵巢內(nèi)有更為活躍的卵泡細(xì)胞分化、發(fā)育及排卵活動，這可能是雙羔組卵巢內(nèi)獨特的調(diào)控機制。

表3 雙羔組卵巢上調(diào)基因中KEGG顯著性富集基因Table 3 Gene lists of significantly enriched KEGG terms of dual group

付紹印等(2017)報道了巴美肉羊下丘腦、垂體、卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)粘附斑以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等通路的基因在上述組織中均出現(xiàn)了差異表達(dá)；而細(xì)胞粘附因子通路基因僅在卵巢組織中出現(xiàn)差異表達(dá)。彭波半細(xì)毛羊卵巢中也出現(xiàn)了細(xì)胞粘附因子通路基因的上調(diào)表達(dá)及富集，因此細(xì)胞粘附因子可能是產(chǎn)雙羔彭波半細(xì)毛羊潛在的篩選標(biāo)志物。另外，本研究發(fā)現(xiàn)了雙羔組卵巢中TGF-beta信號通路基因的上調(diào)和富集，而綿羊繁育力相關(guān)基因MMPR-1B、GDF9、BMP15均為TGF-beta超家族成員，在多羔小尾寒羊卵巢中也發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)TGF-beta信號通路蛋白(賈建磊，2015)。這表明雖然彭波半細(xì)毛羊未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)羔性狀與上述基因的突變有關(guān)，但TGF-beta信號通路的活躍與產(chǎn)羔性狀可能有關(guān)。此外，研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大量溶質(zhì)運載蛋白家族(solute carrier family，SLC)基因出現(xiàn)明顯上調(diào)，SLC7A5基因的qPCR結(jié)果也驗證了相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。溶質(zhì)運載蛋白一般位于細(xì)胞膜等質(zhì)膜上，承擔(dān)著各種生物分子轉(zhuǎn)運的作用。溶質(zhì)運載蛋白基因在雙羔組的卵巢中大量上調(diào)表達(dá)，表明雙羔組卵巢細(xì)胞中的跨膜物質(zhì)運輸機能顯著高于單羔組，從而促使卵巢內(nèi)發(fā)生一系列最終有利于卵泡分化、發(fā)育及排卵的生理過程。這預(yù)示著卵巢細(xì)胞中溶質(zhì)運載蛋白家族基因的上調(diào)表達(dá)亦可作為彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔的一個信號，與此信號相關(guān)的基因或者激素等小分子可以作為彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔性狀的潛在標(biāo)志物進(jìn)行深入研究。

4 總結(jié)

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序研究了產(chǎn)雙羔彭波半細(xì)毛羊卵巢的特異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因1 021個，下調(diào)基因1 468個。對差異基因進(jìn)行功能分析后發(fā)現(xiàn)，雙羔組顯著上調(diào)的基因多與細(xì)胞膜相關(guān)的細(xì)胞活動有關(guān)，如細(xì)胞的粘附、運動、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運。雙羔組彭波半細(xì)毛羊卵巢內(nèi)細(xì)胞的物質(zhì)運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率加快，從而促進(jìn)卵泡的分化和發(fā)育；同時，雙羔組卵巢內(nèi)細(xì)胞的粘附及運動功能增強，更有利于卵母細(xì)胞的成熟和成熟卵子的排出，從而誘導(dǎo)綿羊產(chǎn)雙羔性狀的出現(xiàn)。上述結(jié)果預(yù)示著卵巢內(nèi)細(xì)胞膜相關(guān)生命活動的增強是彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔性狀的一個重要因素。此外，細(xì)胞粘附因子、TGF-beta信號通路以及溶質(zhì)運載蛋白家族基因的上調(diào)表達(dá)可作為彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔性狀的潛在信號進(jìn)行更深入的研究。本研究結(jié)果不僅有助于對彭波半細(xì)毛羊產(chǎn)雙羔性狀內(nèi)在機制的了解，更有助于藏綿羊快速繁育相關(guān)問題的深入研究。