陳 倩，李 丹，佟 巍，蔡方舟，郭 智，鮑琳琳，王 衛(wèi)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實驗室，衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，北京 100021)

目前國內(nèi)尚未建立理想的重癥登革熱動物模型，缺乏指導(dǎo)性強(qiáng)、可靠穩(wěn)定的病原學(xué)指標(biāo)。文獻(xiàn)報告指出病毒的定量檢測可針對病毒顆粒、病毒抗原、病毒核酸等[1]。傳統(tǒng)方法有病毒分離方法，常用細(xì)胞培養(yǎng)分離和乳鼠顱內(nèi)接種分離等，該方法比較可靠，但操作繁瑣，實驗周期長，不利于登革病毒的快速診斷。其次是抗原檢測方法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析法(GICA)和免疫熒光法(IFA)等。但抗原檢測方法操作繁瑣，檢測靈敏度較低，易與其他黃病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性[2-3]。在過去的幾十年，分子診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，使得檢測和鑒定各種病原體更加可靠。其中實時熒光定量PCR方法逐漸成為病毒快速診斷的新的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究對現(xiàn)有登革病毒RT-PCR檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，創(chuàng)建一步法實時熒光定量RT-PCR方法，并用于登革病毒感染小鼠模型的評估。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

2日齡SPF級BALB/c雄性乳鼠20只，體重2～3 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008]，用于登革病毒的擴(kuò)增。4～6周清潔級C57BL/6背景的I型干擾素受體敲除小鼠(Ifnar1-/-)[SCXK(京)2014-0011]，雌雄各半，共計40只，體重18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所北方中心提供，用于登革熱小鼠模型制備。動物實驗方案得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用和管里委員會的批準(zhǔn)(WW18002)。動物飼養(yǎng)與實驗均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所生物安全二級動物實驗室(ABSL-2)，遵照3R原則進(jìn)行。

1.1.2 病毒株

登革病毒(DENV)：I型(TH-Sman株)、II型(New Guinea株/NGC適應(yīng)株/TH-36株)、III型(TH87株)、IV型(H241株)均購自ATCC，本課題組保存。特異性分析所用病毒株包括：腸道病毒71型EV71(MP10株)、柯薩奇病毒10型CA10(SJZK12-0046T株)、柯薩奇病毒16型CA16(Shzh05-1株)、鼠肺炎病毒PVM(15株)、鼠肝炎病毒MHV(A59株)、呼腸孤病毒REO(Abney株)、鼠諾如病毒MNV(CW1株)、及狂犬病毒RV(CVS株)分別由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所腸道病毒課題組、檢測中心及本課題組提供。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit: 52904)和實時熒光定量PCR試劑盒(Probe RT-PCR Kit: 204443)均購自德國Qiagen公司；Applied Biosystems 7500實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物和探針

根據(jù)文獻(xiàn)[4]，選擇特異引物和TaqMan探針，上下游引物及探針序列分別為：5’-GAR AGA CCA GAG ATC CTG CTG TCT-3’; 5’-ACC ATT CCA TTT TCT GGC GTT-3’; 5’-FAM-AGC ATC ATT CCA GGC AC-MGB-3’，委托中美泰和公司合成。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

選擇II型登革病毒(New Guinea株) 3’ UTR的目的片段制備標(biāo)準(zhǔn)品。使用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的基因克隆于TOPO載體，構(gòu)建質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以上操作委托中美泰和公司完成。質(zhì)粒合成后，用紫外分光光度計測定原倍標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒濃度為1035 ng/μL。

1.3.3 動物感染和取材

為擴(kuò)增登革病毒，使用1 mL胰島注射器(BD: 328421)吸取20 μL New Guinea病毒液，顱內(nèi)接種2日齡BALB/c乳鼠(病毒濃度：8×105Copies/μL)。觀察8～9 d，出現(xiàn)麻痹、抽搐癱瘓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，則安樂處死動物。采取鼠腦，研磨；3500 r/min離心15 min，吸取上清凍存于-80℃冰箱。為建立小鼠模型，使用1 mL胰島注射器吸取100 μL New Guinea病毒液，尾靜脈接種Ifnar1-/-小鼠(病毒濃度：8×106Copies/μL)。在感染后第4天(4 Days Postinfection, Dpi.4)采取組織樣本，直接凍存于-80℃冰箱；Dpi.2、4、6、8采取血液樣本，3000 r/min離心10 min，吸取上清凍存于-80℃冰箱。

1.3.4 病毒核酸的提取

本實驗操作在生物安全二級實驗室(BSL-2)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，操作步驟參見試劑盒說明書。簡單地，1.5 mL EP管內(nèi)預(yù)置560 μL病毒裂解液，加入140 μL樣本；靜置10 min，充分裂解。再加560 μL無水乙醇，混勻；轉(zhuǎn)移至2 mL收集柱內(nèi)，8000 r/min；加500 μL AW1，8000 r/min；加500 μL AW2，14000 r/min；空離14000 r/min；換新的1.5 mL EP管；加40 μL AVE，8000 r/min；重復(fù)上一步驟。4℃保存繼續(xù)下一步實驗，或凍存于-80℃冰箱。

1.3.5 一步法實時熒光定量PCR反應(yīng)

根據(jù)表1，配制實時熒光定量PCR反應(yīng)體系；根據(jù)表2，設(shè)定反應(yīng)程序，共40個循環(huán)。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗中得到的數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，NGC株與NGC適應(yīng)株感染的小鼠樣本重復(fù)三次檢測，計算各組數(shù)據(jù)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation, SD)和變異系數(shù)(Coefficient of Variation, CV)[5]。

2 結(jié)果

2.1 一步法實時熒光定量PCR方法的確定

在獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品之后，使用分光光度計測定，測得質(zhì)粒原液DNA濃度為1035 ng/μL。根據(jù)計算公式：質(zhì)?？截悢?shù)(Copies/μL)=6.02×1023(Copies/mol)×質(zhì)粒濃度(g/μL)/質(zhì)粒分子量(g/mol)[6]；原倍質(zhì)?？截悢?shù)為4.96×1011Copies/μL，連續(xù)十倍稀釋，做6個稀釋度，分別使用102～107倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行qRT-PCR，建立擴(kuò)增曲線(圖1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。圖1中1～6為不同的稀釋度，分別為4.96×104～ 4.96×109Copies/μL，可見各梯度間隔得臨界循環(huán)數(shù)(threshold cycle, Ct)基本相等，約3個循環(huán)左右；以II型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出擴(kuò)增效率為95.8%，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明該P(yáng)CR方法擴(kuò)增效率較高，線性關(guān)系良好。

2.2 熒光定量PCR方法的評估

2.2.1 靈敏性分析

為了解該P(yáng)CR方法的靈敏性，將II型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行十倍連續(xù)稀釋(4.96～49.6×1010Copies/μL)，分別進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明：濃度為4.96×101～4.96×1010Copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品都能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，而4.96 Copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品未能檢測到熒光信號(見圖3)。由此可知4.96×101～4.96×1010Copies/μL為該方法可以檢測到的線性范圍，最低檢測線為49.6 Copies/μL，靈敏性較好。

2.2.2 特異性分析

為了解該P(yáng)CR檢測方法的特異性，使用該P(yáng)CR方法分別檢測多種實驗小鼠或小鼠模型常見病毒，包括四種血清型的登革病毒(I型TH-Sman株；II型New Guinea株/TH-36株；III型TH87株；IV型H241株)、腸道病毒(EV71、CA10、CA16)、PVM、PHV、REO、MNV及RV。結(jié)果顯示：只有Ⅰ～Ⅲ型登革病毒(TH-Sman株、New Guinea株/TH-36株、TH87株)產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線，其余病毒均未檢測到熒光信號(見圖4)，說明無交叉反應(yīng)，與預(yù)想一致，表明該P(yáng)CR方法特異性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性分析

為了解該P(yáng)CR方法的穩(wěn)定性，本研究使用登革熱小鼠模型常用的Ⅱ型登革病毒(New Guinea株及NGC適應(yīng)株)來進(jìn)行測試。分別將兩株登革病毒十倍連續(xù)稀釋，共6個梯度，經(jīng)PCR檢測，實驗重復(fù)三次，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：每個稀釋度樣本Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5，且CV值均小于5%，表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curve of the standard

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve

圖3 熒光定量PCR方法的靈敏性Figure 3 Sensitivity of the fluorescence quantitative PCR method

2.3 DENV RT-PCR方法的初步應(yīng)用

為確定該P(yáng)CR方法在登革熱動物模型研究中的實際使用效果，使用Ⅱ型登革病毒New Guinea株和N10株分別感染I型干擾素受體敲除小鼠 (Ifnar1-/-)，獲得感染后不同天數(shù)的血清樣本及感染后第4天的組織樣本。經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，測得小鼠體內(nèi)病毒載量的水平與分布。由圖5可知：New Guinea株感染Ifnar1-/-小鼠，血清樣本中病毒載量水平在感染后第2天達(dá)到高峰，在感染后第8天消失。由圖6可知：登革病毒感染小鼠后，病毒主要分布在小腸、脾、肝、腎和腦。在感染后第4天，不同組織中病毒載量水平具有差異。New Guinea株感染小鼠在腸、腎、肝組織中未見明顯病毒載量，NGC適應(yīng)株感染小鼠在腸、脾、腎組織中可檢測到高水平的病毒核酸，表明了兩株登革病毒在小鼠體內(nèi)的播散和分布情況。本方法使用于登革熱小鼠模型的不同組織樣本，多數(shù)可檢測到熒光信號，Ct值主要介于26～31之間，檢出率良好，表明本檢測方法可應(yīng)用于登革熱小鼠模型的病毒定量檢測。

圖4 熒光定量PCR方法的特異性Figure 4 Specificity of fluorescence quantitative PCR method

表3熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性

Table3Repeatability of the fluorescence quantitative PCR method

稀釋度DilutionCt值1Ct value 1Ct值2Ct value 2Ct值3Ct value 3平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差Standard deviation變異系數(shù)Variable coefficientNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株StrainNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株StrainNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株StrainNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株StrainNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株StrainNGC適應(yīng)株Adapted strainNGC株Strain10017.516.517.616.717.716.517.616.50.1050.1360.59%0.81%10-119.919.819.518.819.719.419.719.30.1960.4870.99%2.51%10-222.223.322.322.722.822.322.522.80.3050.4801.35%2.10%10-326.626.526.126.425.726.326.126.40.4100.0751.57%0.28%10-430.230.729.630.430.029.829.930.30.3230.4601.08%1.51%10-534.634.434.332.834.334.134.433.80.1620.8600.47%2.50%

圖5 II型登革病毒感染I型干擾素受體敲除小鼠血清樣本中病毒載量Figure 5 Viral load in serum samples from Ifnar1-/-mice infected with dengue virus type II

圖6 II型登革病毒感染I型干擾素受體敲除小鼠組織樣本中病毒載量Figure 6 Viral load in tissue samples from Ifnar1-/-mice infected with type II dengue virus

3 討論

登革熱和嚴(yán)重登革熱是由登革病毒感染引起的傳染性疾病，已成為全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，目前仍缺少針對該疾病安全有效的藥物和疫苗[7-8]。合適的動物模型是登革熱防治產(chǎn)品和策略研究的重要工具[9]。熒光定量PCR方法是感染性模型檢測常用的實驗方法。本研究旨在評估可應(yīng)用于登革病毒感染動物模型檢測的一步法實時熒光定量PCR方法，從而為登革熱小鼠模型的建立提供基礎(chǔ)方法，推動疫苗和藥物的研發(fā)進(jìn)程。

登革熱的分子診斷逐漸取代傳統(tǒng)的病毒分離方法，成為病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。在過去十幾年中，已經(jīng)報道了多種基于RT-PCR的方法，主要針對NS1、NS5、3’UTR等基因序列[12-14]。Lanciotti等人[15]最初報道了兩步嵌套式逆轉(zhuǎn)錄PCR，后經(jīng)Harris等[16]改進(jìn)為一步多重逆轉(zhuǎn)錄PCR用于登革病毒的檢測和分型。但使用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增子大小區(qū)分四種血清型的登革病毒，靈敏度較低。Shu等[17]建立的血清型特異的一步法SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，可以用于登革病毒感染急性期的檢測與分型。但由于該染料可非特異性的結(jié)合DNA雙鏈，因而假陽性信號產(chǎn)生的機(jī)率增加[4, 17-18]。Klungthong等[19]使用泰國收集的16454例登革熱患者陽性血清，提高登革病毒檢測的巢式PCR的靈敏度，但該方法需兩次擴(kuò)增步驟，操作相對繁瑣。Sasmono等[10, 20]新建立了Simplexa Dengue 檢測方法，提高了檢測的靈敏度。但是，目前登革病毒的分子檢測方法主要應(yīng)用于臨床樣本，針對登革熱動物模型的檢測方法較少。

本研究改進(jìn)并評估檢測登革病毒的一步法實時熒光定量PCR方法，應(yīng)用于登革熱小鼠模型中。相對于普通的熒光定量PCR方法，本檢測方法具有以下幾個特點(diǎn)。一是使用了新型MGB探針，該探針與一般的TaqMan探針相比具有多種優(yōu)勢。首先，MGB探針在3’端采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，取代了常規(guī)可發(fā)光的熒光標(biāo)記，大大降低反應(yīng)的本底信號強(qiáng)度，提高反應(yīng)的靈敏度。其次，MGB探針比一般探針的Tm值高，約10℃左右，增強(qiáng)反應(yīng)的特異性[12]。二是簡化了操作步驟，縮短了檢測時間。常規(guī)實時熒光定量PCR檢測需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量兩個步驟，所需4～6 h不等；而本檢測方法通過使用一步法，只需約2 h便可得出結(jié)果。三是針對特定的病毒基因型。根據(jù)病毒包膜蛋白E的抗原性不同，登革病毒分為Ⅰ～Ⅳ個血清型。其中Ⅳ型登革病毒的遺傳偏差較大，與Ⅰ～Ⅲ型存在較大的遺傳差異性(33%)[21]。而我們建立的動物模型主要針對Ⅰ～Ⅲ型登革病毒，因此，本方法選擇的引物和探針也是針對Ⅰ～Ⅲ型登革病毒。

本研究使用的登革病毒檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。通過對Ⅱ型登革病毒不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，最低限度達(dá)49.6 Copies/μL，靈敏度較好。同時，對4種血清型的登革病毒和多種實驗小鼠、小鼠模型常見病毒進(jìn)行檢驗，僅登革病毒產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，而EV71、CA10、CA16等其他9株RNA病毒檢測結(jié)果均呈陰性，表明特異性好。使用12份乳鼠腦組織樣品重復(fù)測定3次，標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5，變異系數(shù)小于5%，表明本方法可重復(fù)性高。

登革熱小鼠模型的建立及登革病毒檢測對于登革熱發(fā)病機(jī)理、藥物和疫苗研究具有重要意義[22]。第一代登革熱小鼠模型使用高劑量登革病毒，以顱內(nèi)注射的方式感染免疫健全小鼠，出現(xiàn)了在登革熱患者身上并未觀察到的神經(jīng)癥狀，如四肢癱瘓、麻痹等。第二代模型使用登革病毒感染缺乏干擾素受體的免疫缺陷小鼠，如AG129小鼠等，該模型可模擬部分人類登革熱癥狀，但不適于研究宿主的免疫應(yīng)答[23]。在最近的工作中，研究者期望建立登革病毒的小鼠適應(yīng)株，以低劑量病毒感染小鼠，使其不產(chǎn)生神經(jīng)癥狀，更好的模擬人類登革熱的臨床表現(xiàn)，從而為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。本研究將檢測登革熱患者臨床樣本的實時熒光定量PCR方法改善、評估后，應(yīng)用于登革熱小鼠模型的病毒載量檢測中。通過對40份不同的小鼠組織樣本，如小腸、肝臟、脾臟等和40份血清樣本進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示 Ifnar1-/-小鼠樣品中登革病毒均呈陽性，且病毒載量水平具有差異。表明本檢測方法適用于小鼠模型，登革病毒感染后不同時期及不同樣本中的檢驗，檢出率良好。值得注意的是，本檢測方法用于登革熱動物模型，需要明確具體檢測時間及待檢組織，現(xiàn)有模型樣品在病毒感染8 d之后，無法檢測到陽性結(jié)果；還需明確動物種類及用途等，本研究使用一型干擾素受體敲除小鼠(Ifnar1-/-)，如本方法應(yīng)用于其他物種模型還需要進(jìn)行預(yù)試，避免假陽性和假陰性的出現(xiàn)。

總之，本研究確認(rèn)并評估了一種針對登革病毒的qRT-PCR方法，該方法可特異、靈敏、穩(wěn)定地檢測登革病毒，適用于登革病毒感染動物模型的建立和應(yīng)用工作中，從而促進(jìn)登革熱發(fā)病機(jī)制研究及支撐藥物疫苗研發(fā)。