胡文君，王 品，鄭斯莉，汪東昇，繆朝玉 （第二軍醫(yī)大學/海軍軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海， 200433）

心肌梗死是一種嚴重的心血管疾病，由于冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使心肌持續(xù)性缺血缺氧以致壞死，損害心功能且可能導致心律失常、休克以及心力衰竭等嚴重后果，已成為威脅人類生命健康的重大疾病之一[1-2]。近幾十年來，隨著醫(yī)療技術的進步，再灌注心肌治療可顯著改善心梗患者的生存率，但由于心梗發(fā)生發(fā)展及轉歸過程極其復雜，使其在臨床治療中仍然面臨許多挑戰(zhàn)[3]，因此構建合適的動物模型對探究人心肌梗死的發(fā)病機制和病理過程、評價藥物療效以及探索新的治療方法至關重要。通過結扎冠狀動脈模擬心肌缺血過程來建立心肌梗死的動物模型是目前廣泛應用的較為成熟的方法[4-5]。以往更傾向于選擇較大動物構建模型，隨著基因工程技術的發(fā)展，基因工程小鼠成為炙手可熱的研究工具，因此建立簡便有效的小鼠心梗模型對心肌梗死疾病的深入研究有重要意義。但目前國內關于小鼠心梗模型構建方法的報道較少，缺乏一種比較便捷的模型制作方法和無創(chuàng)評價手段。本文基于Gao 等[6]報道的心梗模型構建方法結合實際操作總結了一些經驗。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 10～12 周 齡 雄 性 小 鼠，共29 只，體重為(29.65±5.35)g，購于海西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗動物均飼養(yǎng)在具有IVC 系統(tǒng)的動物房[人工照明12 h；溫度(23±2)℃；相對濕度40%～60%；噪音≤60 dB]，自由飲食進水，在正式實驗之前需適應飼養(yǎng)環(huán)境至少1 周。動物實驗方案與操作均遵守動物福利及“3R”原則。

1.2 試劑與儀器設備

異氟烷（河北一品制藥）；4%水合氯醛、2%TTC 染液(批號：E110BA0007、AC29BA0025，BBI Life Science)；0.9%NaCl 溶液；4%多聚甲醛組織固定液（批號：154608，博光生物）。氣體麻醉機（上海曼普生物科技有限公司）；恒溫墊；彩色掃描儀（BenQ，K802）；MPA 血壓與心率分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；顯微外科手術器械?？p線（3-0，用于肌肉、皮膚縫合）、縫針；帶線縫針（7-0，用于結扎冠狀動脈）。

2 實驗方法

2.1 術前準備及手術過程

2.1.1 術前準備

所有手術器械使用前均高溫蒸汽滅菌30 min。實驗小鼠術前禁食12 h。按照麻醉機說明書連接好管路。將小鼠放進麻醉機的誘導箱，開啟氧氣調節(jié)氣流量(0.25 MPa，1 L/min)，調整麻醉藥（異氟烷）濃度為5%，約1 min 完成小鼠誘導麻醉，之后調整麻醉藥濃度至2%，連接小鼠面罩并持續(xù)吸入。

2.1.2 手術操作

小鼠仰臥位固定，左胸前手術區(qū)域剔除鼠毛并消毒。距胸骨左緣約1～2 mm 皮膚處做長約1 cm縱向切口，切口處行垂直外翻褥式縫合預留縫線。逐層鈍性分離胸壁肌肉，從第3 或第4 肋間隙快速進入胸腔，用止血鉗撐開肋間隙，配合心臟跳動左手輕輕擠壓使心臟從孔隙中彈出。在左心耳下緣1～2 mm、肺動脈圓錐旁0.5 mm 處以7-0 帶線縫合針穿過冠狀動脈前降支將其結扎，松緊適宜，控制進針深度（以隱約可見細針為宜）和行針寬度（2 mm左右）。由于不借助通氣裝置，要求開胸時間不要超過30 s，結扎操作盡量控制在10 s 左右完成。結扎完成后輕柔地將心臟送回胸腔，擠壓胸腔排出空氣同時收緊結扎切口處預留縫線，完成手術。術中逐步調整麻藥濃度至零，取下面罩后將小鼠置于恒溫墊上約3～5 min 即可復蘇。

2.2 肢體導聯(lián)心電圖

小鼠異氟烷吸入麻醉后，仰臥固定，按照儀器說明連接MPA 系統(tǒng)心臟導聯(lián)線，并將針電極分別固定在右上肢、左上肢，右下肢接地，避免周圍磁場干擾。待基線平穩(wěn)后，記錄4～5 個心動周期。實驗中我們主要使用II 導聯(lián)觀察心臟前下壁心梗發(fā)生的情況，與冠狀動脈左前降支所供給的心肌區(qū)域相吻合。心電圖導聯(lián)的選擇可以根據(jù)實驗需求進行調整。

2.3 TTC 染色及梗死區(qū)域大小計算

術后24 h 對模型小鼠施行安樂死（4%水合氯醛，300 mg/kg），打開胸腔，肉眼觀察心梗部位，并拍照記錄。留取心臟標本置于生理鹽水中，沖洗除去多余的血液，用濾紙吸干液體后修剪，僅保留全心室稱重，記為M1(mg)。全心室心臟標本置于-20 ℃冷凍約30 min 后，將心臟切成厚度為1 mm 左右的薄片若干，經常規(guī)TTC 染色后[7]，進行掃描拍照。剪下白色梗死區(qū)域用濾紙吸干后稱重，記為M2(mg)，梗死區(qū)大小計算以百分比表示，即梗死大小(%)=(M2/M1)×100%。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 實驗結果

3.1 小鼠心梗模型構建成功率

小鼠心梗模型總體成功率為79.3%(23/29)。其中，冠脈結扎術中死亡率為6.8%(2/29)，1 只由于穿刺過深導致心臟破裂出血，1 只由于胸腔暴露時間過長導致氣胸。術后早期(＜4 h)死亡率為10.3%(3/29)；2 只解剖后發(fā)現(xiàn)胸腔內有大量積血，1 只疑為發(fā)生不可逆轉的致死型心律失常。此外，1 只造模失敗未發(fā)生心梗，術后24 h TTC 染色未見明顯梗死區(qū)，且術后即刻和術后4 h 心電圖均無ST 段改變(表1)。

表 1 小鼠心梗模型失敗原因分析及解決方法

3.2 無創(chuàng)肢體導聯(lián)心電圖變化

造模小鼠均施行術后即刻和術后4 h 兩次心電圖檢查，發(fā)現(xiàn)經24 h TTC 染色后證實有心肌梗死發(fā)生的23 只造模成功的小鼠中，兩次心電圖中均呈現(xiàn)出明顯的ST 段抬高以及變異T 波(圖1A)，而造模失敗的小鼠心電圖則沒有明顯異常(圖1B)。

圖 1 小鼠術前、術后即刻和術后4 h 心電圖

3.3 心臟梗死區(qū)域TTC 染色

術后24 h 打開小鼠胸腔，肉眼可見左心室前下壁靠近心尖處呈灰白色(圖2A)。取心臟標本經常規(guī)TTC 染色后，可觀察到梗死區(qū)域呈白色，而非梗死區(qū)域呈紅色(圖2B)。根據(jù)前文提到心梗區(qū)大小的計算方法，本實驗中，心梗模型梗死區(qū)大小最大可達40%，幾乎累及整個左心室；最小為17%，主要集中在心尖部位；梗死區(qū)平均大小為（28±6）%(見表2)。

圖 2 心梗小鼠心臟標本及TTC 染色

表 2 23 只小鼠心肌梗死區(qū)大小情況

4 討論

建立疾病的實驗動物模型常常是研究工作至關重要的一步，需要考慮多方面的因素，使疾病本身特征和研究目的與所建立的動物模型達到盡可能地一致。首先，實驗動物的選擇要考慮各實驗室以及實驗者自身的條件。就心梗模型而言，大動物（豬、犬、兔等）因其心臟在形態(tài)大小、解剖結構以及生理條件上與人類更為相似，構建模型成功率相對較高，通常用于病理生理過程以及藥物治療療效等研究。小動物生命力弱、手術耐受性差，導致模型建立具有一定難度，但由于其能夠建立相關基因工程動物形成較為一致的品系，對于深入研究心肌梗死病理及治療相關機制有重要意義。目前心梗治療研究不斷深入，基于心肌細胞不可再生的特性，移植治療、干細胞治療、基因治療等多種治療手段及相關機制研究成為心梗治療方案的新方向[8-10]，建立一種穩(wěn)定性強、成功率高的小鼠心梗模型是非常必要的。因此，筆者結合小鼠自身特點，在以往大動物模型的基礎上，比較成功地建立了小鼠的心梗模型。

目前建立心肌梗死動物模型的方法有多種，包括：冠脈結扎法、藥物法、球囊堵閉法、栓塞法以及血栓形成法等。其中藥物法主要使用垂體后葉素等誘發(fā)血管痙攣促使心肌缺血梗死，但此法很難明確發(fā)生梗塞的動脈且效果具有不確定性；后三種方法可直接形成冠脈閉塞，但需要借助心導管技術和冠脈造影等影像學技術，且小鼠細小的冠狀動脈給操作增加了難度[11]。而冠狀動脈結扎法[12]操作簡單、血管阻塞明確，比較符合心梗發(fā)生的病理過程，能較好的實現(xiàn)臨床轉化，因此本實驗主要采用此法建立小鼠心梗模型。實驗過程中，采用5%異氟烷誘導后聯(lián)合2%異氟烷面罩持續(xù)吸入麻醉的方法，不同于傳統(tǒng)的腹腔麻醉聯(lián)合氣管插管通氣的方法[13]，避免了氣管插管和機械通氣可能產生的組織損傷，同時也提高了麻醉的安全性和手術效率。但是，此法要求實驗者在短時間內完成冠脈結扎術，盡快完成冠脈結扎并閉合胸壁，降低長時間暴露胸腔可能導致心律失常、氣胸等致死風險。術中需要密切關注小鼠狀況以便及時調整麻藥濃度，從而促進小鼠的術后復蘇。除了安全有效的麻醉方法之外，冠脈結扎位置的選擇至關重要，由于小鼠血管細小，側枝循環(huán)豐富且走行不易觀察，因此要求實驗者操作精確，既要保證能夠引起足夠面積的心肌梗死，又要避免梗死面積過大而導致死亡，盡量在同一高度結扎形成較為一致的模型；此外，小鼠心室壁較薄，操作者需要嚴格控制穿刺深度，避免穿刺過深直接刺破室壁造成大出血。

心梗模型的評價方法可根據(jù)實驗動物的生存狀態(tài)分為活體檢測和尸檢。前者主要包括冠狀動脈造影熒光微粒注射、MRI、PET 和超聲心動圖等[14-15]，這些方法可以獲得冠脈血供狀況從而間接評估心肌梗死，但設備要求高、價格昂貴，檢測操作復雜；后者則主要是染料染色法包括TTC、依文思藍、Masson三色法等，可以獲得心肌梗死的直接結果。心電圖通常是臨床心肌梗死病人首選的實驗室檢查。然而，在動物心梗模型的評價中，人們往往忽視這一最為簡便快捷方法的應用。在本實驗的模型構建中，筆者采用術后即刻和術后4 h 心電圖檢查兩個指標來評估小鼠心梗情況。首先，在術后立刻對模型鼠施行心電圖檢查有助于幫助我們判斷冠脈結扎的初期效果，以及發(fā)現(xiàn)潛在的心律異常改變。其次，考慮到心肌梗死特異性標志物之一——肌鈣蛋白(cTn)，一般在心肌壞死后3～4 h 開始升高[16]，我們又選擇術后4 h 的心電圖檢查，再次對模型小鼠心梗發(fā)生情況進行判斷，同時，排除由于手術對心臟刺激可能造成的假陽性結果，并利用術后24 h TTC 病理染色來驗證心電圖評估心梗發(fā)生的準確情況。最終，發(fā)現(xiàn)心電圖評價心梗發(fā)生的準確性較高，且具有操作簡便、結果獲取迅速、不受場地時間限制、經濟成本低等特點，故而在模型制備結果的評價中較其他活體檢測方法有明顯優(yōu)勢。

本研究成功構建了小鼠心肌梗死模型并利用TTC 染色法明確區(qū)域。同時觀察到，心梗模型小鼠早期心電圖呈現(xiàn)出明顯ST 段抬高可以作為心梗發(fā)生的可靠依據(jù)，即心電圖可以作為小鼠心梗模型早期快速無創(chuàng)評價的可靠方法。因此，本實驗建立的關于小鼠心肌梗死模型的高效制作方法和無創(chuàng)評價手段為確切研究心梗病理生理及治療機制提供了良好選擇。