劉佳音 李儒劍 齊雙慧 孫艷君 尹曉佳 米鐵柱 李繼明

摘要?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是獨立于細胞核遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)之外的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為植物導(dǎo)入外源基因提供了新的途徑。葉綠體轉(zhuǎn)化具有細胞核轉(zhuǎn)化所沒有的優(yōu)點，隨著葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，其優(yōu)越性也逐漸得到認同。從葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理、發(fā)展歷程、特點以及葉綠體轉(zhuǎn)化的方法及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面進行總結(jié)，并對其未來的研究進行展望。

關(guān)鍵詞?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，基因槍，母系遺傳，定點整合

中圖分類號?Q943文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）06-0016-04

Abstract??Chloroplast genetic transformation system is independent of nuclear genetic transformation system，which provides a new approach for plants to intergrate exogenous genes.Chloroplast transformation has advantages not found in nuclear transformation.With the development and application of chloroplast genetic transformation technology，its advantages are gradually recognized.The principles，development process，characteristics，methods and application fields of chloroplast transformation system were summarized，and its future research was prospected.

Key words?Chloroplast genetic transformation，Gene gun，Maternal inheritance，Sitespecific expression

自1983年煙草轉(zhuǎn)基因成功以來[1]，以轉(zhuǎn)基因為代表的植物基因工程在農(nóng)業(yè)、制藥工程等領(lǐng)域掀起了一場變革。然而，隨著研究的不斷深入，研究人員逐漸認識到核轉(zhuǎn)化技術(shù)存在著一系列難以克服的缺點，較大的細胞核基因組、復(fù)雜的遺傳背景使得外源基因的插入整合位點及拷貝數(shù)難以控制和預(yù)測，造成轉(zhuǎn)化子中外源基因表達效率低下且在后代中不能實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，同時容易出現(xiàn)各種位置效應(yīng)以及基因沉默、基因失活現(xiàn)象。再者，外源基因隨花粉飄散而發(fā)生漂移，環(huán)境安全難以保證等[2]。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)則彌補了核轉(zhuǎn)化的缺陷。葉綠體（chloroplast）屬于質(zhì)體（plastid）的一種，廣泛存在于植物和真核藻類的細胞中，是細胞進行光合作用的主要場所。葉綠體是半自主細胞器，其基因組與原核生物類似，每個細胞中含有10～100個不等的、大小在120～160 kb的裸露雙鏈閉合環(huán)狀DNA，一般由一對反向重復(fù)序列和大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)組成，每個葉綠體中基因組以成千上萬個拷貝的形式存在，內(nèi)部堿基分布不均勻，功能相關(guān)的基因多以“多順反子”形式存在[3]。高等植物葉綠體基因組編碼100個左右的基因，與大約3 000個核編碼蛋白一起，構(gòu)成了葉綠體的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)，進行包括光合作用、氨基酸和脂肪酸生物合成等在內(nèi)的復(fù)雜新陳代謝過程[4]。早在1988年，Boynton等[5]利用基因槍轟擊法實現(xiàn)了外源基因?qū)雴渭毎孱惖娜~綠體，此后在種子植物煙草中也實現(xiàn)了葉綠體穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化[6]。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)相對于核轉(zhuǎn)化技術(shù)而言，目的基因表達極為高效，而且沒有位置效應(yīng)，不會產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，同時其多順反子表達、母性遺傳和安全性高的特點，使其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)了極高的價值，除煙草外，番茄[7]、馬鈴薯[8]、大豆[9]、萵苣[10-11]和模式作物擬南芥[12]等植物的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化也取得了成功。筆者從葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)系統(tǒng)的原理、特點、發(fā)展歷程及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面進行總結(jié)。

1?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理和發(fā)展

1.1?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理

葉綠體是綠色植物及真核藻類進行光合作用的場所，光合作用合成的有機物是整個生物界最基本的能量來源。葉綠體通過光合作用實現(xiàn)氧氣生產(chǎn)、碳固定以及淀粉合成，同時進行氨基酸、脂肪酸合成等重要生物反應(yīng)[13]。高等植物葉綠體基因組大小在120～160 kb，在每個細胞中含有1 000～10 000個拷貝[14]，一般典型的陸生植物的葉綠體基因組含有110～120個基因[15]。葉綠體是半自主性細胞器，受細胞核的控制，同時也能進行自我復(fù)制，大多數(shù)被子植物葉綠體的遺傳為母系遺傳，因此非常適合轉(zhuǎn)化。

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要采用同源重組機制和位點特異性整合2種方式進行轉(zhuǎn)化[16]。同源重組方式是通過同源重組，將目的DNA片段特異性插入到葉綠體基因組的某一位點中，該技術(shù)的原理是在載體構(gòu)建過程中于外源DNA片段兩側(cè)連接一段與受體葉綠體基因組插入位點兩側(cè)片段同源的DNA序列，載體導(dǎo)入葉綠體后，目的DNA兩側(cè)的同源片段與葉綠體基因組發(fā)生同源重組，目標(biāo)片段特異性整合到葉綠體基因組中的設(shè)計插入位點中。外源基因的位點特異性插入既不會造成葉綠體基因組序列的丟失和破壞，又不會影響原有基因的功能，避免了位置效應(yīng)，有利于基因的穩(wěn)定遺傳和表達。噬菌體phiC31介導(dǎo)的位點特異性整合法主要基于特異性整合酶（INT）能夠介導(dǎo)噬菌體attP與細菌attB位點之間整合的原理[17]，首先通過同源重組將細菌attB位點整合到葉綠體基因組的特定位點中，之后以該轉(zhuǎn)基因株系為下一步遺傳轉(zhuǎn)化的受體，在INT酶的介導(dǎo)下實現(xiàn)帶有attP位點的質(zhì)粒與葉綠體基因組中attB位點的整合，將目的基因插入到葉綠體基因組中[18]，這種方法提高了外源基因向葉綠體基因組的整合效率。

1.2?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展

葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究瓶頸往往在如何將目的基因定向?qū)肴~綠體和如何實現(xiàn)同質(zhì)化上。葉綠體基因組以多拷貝的形式存在于植物葉綠體中，目前還沒有辦法實現(xiàn)通過一次性操作使所有葉綠體基因組帶有目的基因。在進行遺傳轉(zhuǎn)化前降低葉綠體基因組的拷貝數(shù)或選擇致死型突變體進行遺傳轉(zhuǎn)化能夠在一定程度上提高葉綠體轉(zhuǎn)化的成功率，但實現(xiàn)同質(zhì)化最常用的方法為高篩選壓下的多代篩選，因此確定合適的篩選標(biāo)記基因?qū)θ~綠體轉(zhuǎn)化的同質(zhì)化進程非常關(guān)鍵。Michel等[19]將aadA基因作為篩選標(biāo)記基因進行衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化，獲得的衣藻轉(zhuǎn)化子具備壯觀霉素和鏈霉素抗性，Svab等[20]將16SrRNA的突變體基因作為轉(zhuǎn)化煙草葉綠體的篩選標(biāo)記用于葉綠體轉(zhuǎn)化中的抗性篩選，獲得的再生植株表現(xiàn)出對鏈霉素的抗性，Huang等[21]報道了基因aphA6為卡那霉素抗性基因。盡管抗生素篩選標(biāo)記基因的應(yīng)用已日趨成熟，但也存在很大的弊端。為了解決這一問題，科學(xué)家在葉綠體轉(zhuǎn)化研究中探索了一系列非抗生素抗性基因用作篩選標(biāo)記。Daniell等[22]在葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化中將菠菜中的甜菜堿醛脫氫酶基因作為篩選標(biāo)記基因，細菌的Bar基因、β-葡萄糖醛酸酶基因（GUS）、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因（CAT）和綠色熒光蛋白基因（GFP）作為報告基因也用于葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化中，其中綠色熒光蛋白基因（GFP）表達產(chǎn)生的綠色熒光蛋白可以直接在活體中進行檢測。

葉綠體轉(zhuǎn)化應(yīng)用廣泛，科研人員正致力于在模式植物及重要農(nóng)作物中實現(xiàn)葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化。然而葉綠體轉(zhuǎn)化在植物中的實現(xiàn)和推廣非常困難，僅有少數(shù)離體培養(yǎng)存活性和再生性較好的植物獲得了轉(zhuǎn)化植株，包括幾種茄科植物、萵苣、楊樹等[23-24]。對模式植物擬南芥而言，葉綠體轉(zhuǎn)化后的再生植株常表現(xiàn)雄性不育或雌性不孕，盡管有的研究在一定程度上提高了擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)化的效率，但育性問題尚未解決[25]。

2?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特點

葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)與核轉(zhuǎn)化技術(shù)相比具有以下多方面的優(yōu)點。

2.1?定點整合、表達高效

在葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建過程中，根據(jù)設(shè)計的同源片段，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在葉綠體基因組上的定點插入，這避免了核轉(zhuǎn)化中外源基因的隨機整合造成的位置效應(yīng)、基因沉默以及順式失活等問題。此外，由于葉綠體基因組在葉綠體中以較高拷貝數(shù)形式存在，相應(yīng)地，外源基因整合到葉綠體基因組后也會有大量拷貝，極大提高了外源基因的表達量。

2.2?多順反子表達?葉綠體基因的表達模式類似原核生物，一個啟動子可以啟動多個基因的轉(zhuǎn)錄，為多順反子表達模式。這種表達模式為一次性轉(zhuǎn)化多個基因提供了可能。

2.3?遺傳穩(wěn)定、安全性高?經(jīng)過葉綠體轉(zhuǎn)化獲得的再生植株，外源基因隨葉綠體基因組進行母性遺傳，因此后代性狀不會發(fā)生分離，使得這種純系能夠一直保持。另外，外源基因不會存在于花粉中，不存在花粉漂移的現(xiàn)象，避免了轉(zhuǎn)基因?qū)Νh(huán)境帶來的污染。所以在轉(zhuǎn)基因生物安全的角度上，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物不存在外源基因隨花粉擴散的風(fēng)險，是符合安全要求的。

2.4?便于操作，對細胞影響小?葉綠體基因組小、結(jié)構(gòu)簡單，同時，由于葉綠體雙層脂質(zhì)膜的存在使外源基因表達的外源蛋白不會釋放到細胞質(zhì)基質(zhì)中，避免了外源基因表達對細胞造成的不利影響。

3?葉綠體轉(zhuǎn)化的方法

將外源基因?qū)肴~綠體的常用方法包括基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、花粉管導(dǎo)入法、顯微及激光注射法以及納米基因載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法等。

3.1?基因槍法

利用基因槍進行遺傳轉(zhuǎn)化的方法開始于20世紀(jì)80年代，基因槍的出現(xiàn)促進了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，尤其是多基因共轉(zhuǎn)化，同時基因槍轉(zhuǎn)化也是葉綠體轉(zhuǎn)化領(lǐng)域應(yīng)用最多、最有效的方法。其原理是將外源DNA黏附在金屬顆粒表面，然后在高壓動力作用下將金屬顆粒轟擊受體細胞，實現(xiàn)外源DNA向細胞的導(dǎo)入?；驑屴D(zhuǎn)化法不受物種與基因型限制，基因槍轟擊后的植物組織可以迅速完成再生分化獲得植株。目前報道的大多數(shù)葉綠體轉(zhuǎn)化成功的案例都是通過基因槍轉(zhuǎn)化法實現(xiàn)的。

Ruf等[26]結(jié)合對核基因的基因編輯技術(shù)，開發(fā)了一種高效穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化方法，該研究首先通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除核基因組中的一個抑制葉綠體基因翻譯的基因ACC2，獲得的植株在葉綠體轉(zhuǎn)化過程中對奇霉素抗性的敏感性增強，利用靶向擬南芥葉綠體載體pCH8，通過基因槍轉(zhuǎn)化根系愈傷組織，奇霉素篩選，獲得了葉綠體轉(zhuǎn)基因植株，且通過與野生型的正反交試驗發(fā)現(xiàn)奇霉素抗性能夠通過母性遺傳在后代中保留。但有研究表明基因槍轉(zhuǎn)化會對受體基因組造成破壞，包括染色體截短、大片段缺失和染色體斷裂-融合-橋循環(huán)等損傷[27]。

3.2?PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法?PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法常作為基因槍轉(zhuǎn)化法的替代方法[28]，該方法不受專利保護，不需要昂貴的設(shè)備，但對技術(shù)要求較高，更費時費力。該方法的原理是：除去細胞壁的植物細胞原生質(zhì)體在PEG的作用下細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，原生質(zhì)體縮水，在細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆破壞前去除PEG，則細胞膜結(jié)構(gòu)將恢復(fù)原來的狀態(tài)，外源DNA在這一過程中有機會進入植物細胞以及質(zhì)體中，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。PEG介導(dǎo)的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化依賴于成熟的原生質(zhì)體再生體系，目前已在煙草[29]、番茄[30]、花椰菜[31]、萵苣[32]等植物中取得成功。

3.3?花粉管導(dǎo)入法?pabA基因是來源于龍葵的抗阿特拉津基因。劉博林等[33]將含有pabA基因的pBR322質(zhì)粒通過花粉管通道注入大豆子房中，得到的后代具有阿特拉津抗性。在后代的葉綠體中成功檢測到pBR322 DNA的存在，但沒有證明外源基因是否整合在葉綠體基因組中。

3.4?顯微及激光注射法

Weber[34]報道了一種通過激光照射進行葉綠體轉(zhuǎn)化的方法。將油菜離體葉綠體置于DNA溶液中并用波長為343 nm的激光照射，觀察到葉綠體膜上出現(xiàn)了小洞并持續(xù)存在了112 s，通過后續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)外源DNA已經(jīng)進入到葉綠體中。該方法盡管能夠?qū)崿F(xiàn)將外源DNA向葉綠體中的導(dǎo)入，但利用激光照射法直接照射細胞、組織或器官進行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法鮮見報道。

3.5?納米基因載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

納米材料具有化學(xué)、熱力學(xué)性能穩(wěn)定、粒徑小、比表面積大等特性，可作為DNA甚至蛋白質(zhì)的載體用于動植物遺傳轉(zhuǎn)化。納米材料介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在動物中應(yīng)用廣泛，但由于植物細胞壁的存在使得該技術(shù)在植物遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中受到了一定限制。納米基因載體與病毒載體不同，其沒有毒性或毒性很低，容易被細胞接受，同時可通過對其表面官能團進行修飾，使其在基因傳輸過程中的靶向性增強[35-36]。此外，與基因槍相比，納米載體所能攜帶的分子不僅限于DNA，可以實現(xiàn)RNA、蛋白質(zhì)等其他生物大分子的遞送[37]。納米載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化適用于大多數(shù)植物，且可以實現(xiàn)將生物大分子直接向植物成熟組織的遞送，因此避免了繁瑣的再生分化步驟。Torney等[38]報道了一種利用介孔二氧化硅納米材料 （mesoporous silica nanoparticle，MSN）向植物離體細胞或正常組織者遞送DNA的方法，通過將含有GFP的質(zhì)粒裝載到MSN系統(tǒng)中，并用納米金材料包裹，利用基因槍轟擊煙草子葉后，成功檢測到了熒光信號。

Kwak等[39]在納米材料向植物葉綠體中遞送DNA的研究中取得了突破進展。利用一種由殼聚糖復(fù)合單壁碳納米管（chitosan-complexed single-walled carbon nanotubes，CS-SWNTs ）組成的納米顆粒，將外源DNA定向地導(dǎo)入到植物葉綠體中，開創(chuàng)了葉綠體轉(zhuǎn)化的新方法。該納米材料攜帶正電荷，可松散結(jié)合帶有負電荷的質(zhì)粒DNA，形成pDNA-SWNT復(fù)合物。pDNA-SWNT復(fù)合物通過葉片氣孔進入葉片內(nèi)部，復(fù)合物在脂質(zhì)交換膜滲透（lipid exchange envelope penetration，LEEP）機制下能夠穿越細胞壁、細胞膜以及葉綠體的雙層脂質(zhì)膜，進入葉綠體中，在葉綠體基質(zhì)的弱酸性環(huán)境下，質(zhì)粒DNA釋放并進一步表達。該方法不需要額外的試劑和設(shè)備，已經(jīng)實現(xiàn)了外源DNA向蕓芥、豆瓣菜、煙草和菠菜以及擬南芥葉肉原生質(zhì)體葉綠體的遞送和瞬時表達。

4?葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用

自單細胞藻類及種子植物煙草實現(xiàn)了葉綠體穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化以來，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物技術(shù)研究領(lǐng)域展現(xiàn)了極高的價值，在為研究細胞內(nèi)質(zhì)體基因的表達調(diào)控和功能、核質(zhì)互作提供了方法的同時，也為分子農(nóng)業(yè)和作物改良開辟了新道路。

質(zhì)體被稱為植物細胞的“生物合成中心”，很多代謝反應(yīng)在質(zhì)體中進行。由于葉綠體具有很多優(yōu)點，為葉綠體基因工程應(yīng)用于作物性狀改良提供了條件，并且已經(jīng)實現(xiàn)了作物在抗除草劑[40-41]、抗蟲[42]、抗病[43]、耐鹽[44]等上的應(yīng)用。將抗蟲基因轉(zhuǎn)化葉綠體，能夠?qū)崿F(xiàn)其在葉綠體中的大量高效表達，Kota等[45]和Cosa等[46]研究表明，在葉綠體轉(zhuǎn)化中不需要對Cry基因的序列進行任何調(diào)整便可使其葉綠體中正常表達。Chakrabarti等[47]研究表明，質(zhì)體中的Cry9Aa2基因表達的殺蟲蛋白含量很高，但超過細胞質(zhì)可溶蛋白的10%時，會對植物生長起抑制作用。劉青青[48]又成功地將Cry基因?qū)氲酱蠖购陀筒酥?，這說明葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物改良方面前景廣闊。通過葉綠體轉(zhuǎn)化將抗菌肽MSI299基因?qū)霟煵葜锌墒雇庠吹鞍椎谋磉_量占到可溶性蛋白總量的21.5%～43.0%[49]。將外源基因TPS1轉(zhuǎn)化葉綠體后，植物體內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖含量比核轉(zhuǎn)化技術(shù)提高了25倍[50]。通過葉綠體轉(zhuǎn)化提高煙草抗除草劑能力在煙草中已經(jīng)獲得成功，質(zhì)體表達Bar基因蛋白可占到細胞可溶性蛋白的7%以上[51]。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以其眾多的優(yōu)點也在生物制藥上得到越來越多的應(yīng)用，尤其是在作為生物反應(yīng)器進行食用結(jié)晶蛋白和人類藥用蛋白的生產(chǎn)等方面[52]，目前為止已經(jīng)用在生產(chǎn)疫苗類的霍亂毒素、破傷風(fēng)毒素、動物疫苗等，醫(yī)療性蛋白如人類生長素、胰島素類生長因子等中。

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立也為其自身研究和核質(zhì)互作研究提供新方法，如葉綠體中核糖體的組裝、葉綠體基因轉(zhuǎn)錄的研究以及葉綠體基因翻譯的研究等方面。然而，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也有其自身的缺點，限制了葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用。

5?問題與展望

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過科學(xué)家的努力，近些年也取得了一些很大的發(fā)展，在擬南芥、油菜、水稻、馬鈴薯、生菜、胡蘿卜等植物中均有相關(guān)研究，但在高等植物中僅在煙草中獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)之所以沒有廣泛應(yīng)用于育種中主要原因如下：①葉綠體基因組序列信息的限制。目前具有完整的葉綠體基因組序列信息的植物非常少，大多數(shù)植物葉綠體基因組尚未測序，沒有公開的基因組序列，在載體構(gòu)建過程中無法確定用于外源基因的插入的同源片段。②組織培養(yǎng)體系的限制。選擇合適的植物器官或組織片段作外植體是高效進行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的一個關(guān)鍵方面。禾本科作物愈傷組織往往由幼穗或成熟胚經(jīng)過誘導(dǎo)獲得，如果利用愈傷組織進行葉綠體轉(zhuǎn)化，用于遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織中不含有成熟葉綠體，而是葉綠體的前體前質(zhì)體，體積比葉綠體更小，更難以實現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入，另外禾本科植物葉片較難進行脫分化和再分化，這也是葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化較難進行的一個原因。③轉(zhuǎn)化植株同質(zhì)化方法的限制。如果要獲得真正意義上的葉綠體轉(zhuǎn)化體就意味著在每個拷貝的質(zhì)體基因組中都必須有外源基因的存在。高效獲得葉綠體轉(zhuǎn)化事件的另一關(guān)鍵因素在于建立合適的篩選培養(yǎng)體系，采取相應(yīng)手段促進高效篩選。目前采用的高篩選壓進行多輪再生，以及在轉(zhuǎn)化前降低受體細胞中葉綠體DNA拷貝數(shù)都是耗時長、操作復(fù)雜的過程。今后在一定時期內(nèi)葉綠體轉(zhuǎn)化迫切需要解決上述一系列問題。

隨著對葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的研究深入以及新材料、新技術(shù)在葉綠體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，將很有可能作為一個重要工具用于植物研究，也將推動植物生物技術(shù)的進一步發(fā)展。

參考文獻

[1] ZAMBRYSKI P，JOOS H，GENETELLO C，et al.Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity[J].EMBO J，1983，2（12）：2143-2150.

[2] 張景昱，張中林，蘇寧，等.葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化：植物導(dǎo)入外源基因的新途徑[J].植物學(xué)通報，2001，18（3）：288-294.

[3] 劉良式.植物分子遺傳學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1998：1-56.

[4] YU Q，LUTZ K A，MALIGA P.Efficient plastid transformation in Arabidopsis[J].Plant Physiol，2017，175（1）：186-193.

[5] BOYNTON J E，GILLHAM N W，HARRIS E H，et al.Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles[J].Science，1988，240（4858）：1534-1538.

[6] SVAB Z，MALIGA P.Highfrequency plastid transformation in tobacco by selection for a chimeric aadA gene[J].Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：913-917.

[7] RUF S，HERMANN M，BERGER I J，et al.Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit[J].Nat Biotechnol，2001，19：870-875.

[8] VALKOV V T，GARGANO D，MANNA C，et al.High efficiency plastid transformation in potato and regulation of transgene expression in leaves and tubers by alternative 5and 3 regulatory sequences[J].Transgenic Res，2011，20：137-151.

[9] DUFOURMANTEL N，PELISSIER B，GARCON F，et al.Generation of fertile transplastomic soybean[J].Plant Mol Biol，2004，55：479-489.

[10] KANAMOTO H，YAMASHITA A，ASAO H，et al.Efficient and stable transformation of Lactuca sativa L.cv.Cisco （lettuce） plastids[J].Transgenic Res，2006，15：205-217.

[11] RUHLMAN T，VERMA D，SAMSON N，et al.The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression[J].Plant Physiol，2010，152：2088-2104.

[12] SIKDAR S R，SERINO G，CHAUDHURI S，et al.Plastid transformation in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Rep，1998，18：20-24.

[13] VERMA D，DANIELL H.Chloroplast vector systems for biotechnology applications[J].Plant Physiol，2007，145（4）：1129-1143.

[14] DANIELL H，COHILL P R，KUMAR S，et al.Chloroplast genetic engineering，in molecular biology and biotechnology of plant organelles[M].Netherlands：Springer，2004：443-490.

[15] 黃沖，吳乃虎.葉綠體分子生物學(xué)研究進展[J].中國生物工程雜志，1990，10（6）：24-29.

[16] 錢雪艷，楊向東，郭東全，等.植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化及研究進展[J].分子植物育種，2008，6（5）：959-966.

[17] LUTZ K A，CORNEILLE S，AZHAGIRI A K，et al.A novel approach to plastid transformation utilizes the phiC31 phage integrase[J].Plant J，2004，37：906-913.

[18] THORPE H M，SMITH M C.In vitro sitespecific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（10）：5505-5510.

[19] MICHEL G.Transgenic expression if aminoglycoside adenine transferase in the chloroplast：A selectable marker for sitedirected transformation of chlamydomonas[J].Nucleic Acids Res，1991，19（15）：4083-4089.

[20] SVAB Z，HAJDUKIEWICZ P，MALIGA P.Stable transformation of plastids in higher plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，1990，87（21）：8526-8530.

[21] HUANG F C，KLAUS S，HERZ S，et al.Efficient plastid transformation in tobacco using the aphA-6 gene and kanamycin selection[J].Mol Genet Genomics，2002，268（1）：19-27.

[22] DANIELL H，MUTHUKUMAR B，LEE S.Marker free transgenic plants：Engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection[J].Curr Genet，2001，39（2）：109-110.

[23] SIDOROV V A，KASTEN D，PANG S Z，et al.Stable chloroplast transformation in potato：use of green fluorescent protein as a plastid marker[J].Plant J，1999，19（2）：209-216.

[24] OKUMURA S，SAWADA M，PARK Y W，et al.Transformation of poplar （Populus alba） plastids and expression of foreign proteins in tree chloroplasts[J].Transgenic Res，2006，15（5）：637-646.

[25] HIBBERD J M.A major advance in plastid transformation[J].Plant Physiol，2017，175：5.

[26] RUF S，F(xiàn)ORNER J，HASSE C，et al.Highefficiency generation of fertile transplastomic Arabidopsis plants[J].Nat Plants，2019，5（3）：282.

[27] LIU J，NANNAS N J，F(xiàn)U F，et al.Genomescale sequence disruption following biolistic transformation in rice and maize[J].Plant Cell，2019，31（2）：368-383.

[28] 母連勝，何勇，田志宏.植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及應(yīng)用研究進展[J].長江大學(xué)學(xué)報（自科版），2017，14（14）：52-57.

[29] DAZ A H，KOOP H U.Nicotiana tabacum：PEGmediated plastid transformation[J].Methods Mol Biol，2014，1132：165.

[30] NUGENT G D，TEN HAVE M，VAN DER GULIK A，et al.Plastid transformants of tomato selected using mutations affecting ribosome structure[J].Plant Cell Rep，2005，24：341-349.

[31] NUGENT G D，COYNE S，NGUYEN T H，et al.Nuclear and plastid transformation of Brassica oleracea var.Botrytis （cauliflower） using PEGmediated uptake of DNA into protoplasts[J].Plant Sci，2005，170：135-142.

[32] LELIVELT C L，MCCABE M S，NEWELL C A，et al.Stable plastid transformation in lettuce （Lactuca sativa L.）[J].Plant Mol Biol，2005，58：763-774.

[33] 劉博林，岳紹先，胡乃璧，等.龍葵Atrazine抗性基因向大豆葉綠體的轉(zhuǎn)移及在轉(zhuǎn)基因植株中的表達[J].中國科學(xué)（B輯），1989（7）：699-705.

[34] WEBER G.Uptake of DNA in chloroplast Brassica napus facilitated by a UV-laser microbeam[J].Eur J Cell Biol，1989，49：73-79.

[35] 孔倩倩，李志輝，王瓊，等.納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2010（6）：6-12.

[36] 王安琪，朱華新，趙翔，等.基于納米基因載體的動植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].生物技術(shù)進展，2018（4）：293-301.

[37] RAFSANJANI M S O，ALVARI A，SAMIM M，et al.Application of novel nanotechnology strategies in plant biotransformation：A contemporary overview[J].Recent Pat Biotechnol，2012，6（1）：69-79.

[38] TORNEY F，TREWYN B G，LIN V S Y，et al.Mesoporous silica nanoparticles deliver DNA and chemicals into plants[J].Nat Nanotechnol，2007，2（5）：295-300.

[39] KWAK S Y，LEW T T S，SWEENEY C J，et al.Chloroplastselective gene delivery and expression in planta using chitosancomplexed singlewalled carbon nanotube carriers[J].Nat Nanotechnol，2019，14（5）：447-455.

[40] DANIELL H，DATTA R，VARMA S，et al.Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome[J].Nat Biotechnol，1998，16：345-348.

[41] KANG T J，SEO J E，LOC N H，et al.Herbicide resistance of tobacco chloroplasts expressing the ?bar gene[J].Mol Cells，2003，16：60-66.

[42] MCBRIDE K，SVAB Z，SCHAAF D，et al.Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco[J].Biotechnol，1995，13：362-365.

[43] DEGRAY G，RAJASEKARAN K，SMITH F，et al.Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to control phytopathogenic bacteria and fungi[J].Plant Physiol，2001，127：852-862.

[44] KUMAR S，DHINGRA A，DANIELL H.Plastidexpressed betaine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells，roots and leaves confers enhanced salt tolerance[J].Plant Physiol.，2004，136：2843-2854.

[45] KOTA M，DANIELL H，VARMA S，et al.Overexpression of the Bacillus thuringiensis（Bt）CryAa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Btresistant insects[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：1840-1845.

[46] COSA B D，MOAR W，LEE S B，et al.Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals[J].Nat Biotechnol，2001，19：71-74.

[47] CHAKRABARTI S K，LUTZ K A，LERTWIRIYAWONG B，et al.Expression of thecry9Aa2 B.t.gene in tobacco chloroplasts confers resistance to potato tuber moth[J].Transgenic Res，2006，15（4）：481-488.

[48] 劉青青.油菜葉綠體轉(zhuǎn)化研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[49] 李珺.幾種新型細胞器植物生物反應(yīng)器的研究[J].生物技術(shù)通報，2008（3）：33-35.

[50] LEE S B，KWON H B，KWON S J，et al.Accumulstion of trehalose within transgenic chloroplasts confers drought tolerance[J].Mol Breed，2003，11：1-13.

[51] LUTZ K A，KNAPP J E，MALIGA P.Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance[J].Plant Physiol，2001，125（4）：1585-1590.

[52] DANIELL H，KHAN M S，ALLISON L.Milestones in chloroplast genetic engineering：An environmentally friendly friendly era in biotechnology[J].Trends Plant Sci，2002，7：84-91.