耿文慧，盧紹基，明艷林*

(1.廈門塔斯曼生物工程有限公司，福建 廈門 361000；2.福建省亞熱帶植物研究所/ 福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale) 為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，主要分布在我國西南、華南及華東地區(qū)，是我國藥用石斛的主要品種之一[1]。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，鐵皮石斛的干燥莖具有益胃生津、滋陰清熱等作用，是一味名貴的中藥材[2—3]。鐵皮石斛花、葉具有滋陰潤燥、理氣安神等功效，是調(diào)理身體的養(yǎng)生佳品[4—5]。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛花、葉、莖中成分不同，功效亦有差別。莖中主要有多糖[6]、糖苷類[7]、氨基酸[7]等成分，其中多糖含量可達31.9%[8]。花、葉富含多糖[9]、黃酮[10]、氨基酸[11]等，其中黃酮在花中可達2.31%[12]。鐵皮石斛花、葉、莖均具有抗氧化、降血糖、增強免疫等功效[13—16]，但不同部位的功效對比鮮有報道。本文通過對鐵皮石斛多糖、生物堿、黃酮等化學(xué)成分的測定，以及水提物、醇提物抗氧化活性研究，比較鐵皮石斛不同部位的活性成分含量及提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 年生鐵皮石斛的花、莖、葉干燥品由廈門塔斯曼生物工程有限公司提供，采摘時間為2019 年6～7 月。樣品粉碎過40 目篩備用。

主要試劑：葡萄糖、Vc、蘆丁(標準品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；DPPH、ABTS(分析純，美國Sigma-Aldrich 公司)；苯酚、鄰苯二氫鉀、氫氧化鈉、溴甲酚綠、對氨基苯磺酸(分析純，西隴化工股份有限公司)；過硫酸鉀、氯仿、無水乙醇、硫酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

主要儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號DHG-9075A，上海一恒科技有限公司)；三用恒溫水箱(型號AH-W600，金壇市醫(yī)療儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號2100，東京EYELA 理化器械株式會所)；循環(huán)水式真空泵(型號SHB-II，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；真空冷凍干燥機(型號A 聯(lián)培ha-4LDplus，德國Christ 公司)；三用紫外分析儀(型號ZF-20D，上海越眾儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 多糖含量測定

1.2.1 標準曲線制備

取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，定容至100 mL。取對照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,分別置于5 mL 離心管中，各加水補至1.0 mL，加入5%苯酚溶液0.5 mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)，再加硫酸2.5 mL，避光30 min。以蒸餾水為空白。按照紫外–可見分光光度法，在490 nm 波長處測定吸光度。標準曲線方程為y=11.691x+0.052，R2=0.9996。

1.2.2 樣品制備

分別稱取恒溫干燥的鐵皮石斛花、葉、莖1 g，將料液比為1:30 的樣品首先利用超聲破壁30 min，超聲溫度50 ℃，水浴90 min。將樣液與95%乙醇按1:4 比例混合，搖勻，置于4 ℃過夜，離心，將沉淀物揮發(fā)乙醇后稀釋10 倍備用。將鐵皮石斛花、葉、莖沉淀物樣液分別稀釋，按照1.2.1 測定多糖含量。

1.3 總黃酮含量測定

1.3.1 標準曲線制備

稱取蘆丁2 mg，用95%乙醇定容至10 mL。取蘆丁標準溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 于5 mL 離心管，加95%乙醇定容至2 mL。加5% AlCl3乙醇(95%)溶液2.00 mL。室溫孵育10 min。用紫外分光光度計于415 nm 波長處測定吸光度值。以95%乙醇溶液為空白。標準曲線方程：y=11.296x+0.005，R2=0.9998。

1.3.2 樣品制備

分別稱取鐵皮石斛花、葉、莖1 g，按照料液比1:30 加入80%乙醇30 mL，50 ℃水浴提取2 h。取樣液離心、稀釋，按照1.3.1 測定鐵皮石斛黃酮含量。樣品的吸光度值記為B1。以95%乙醇代替AlCl3溶液制備本底，記為B2。按照標準曲線方程計算總黃酮含量。

1.4 生物堿含量測定

1.4.1 標準曲線制備

稱取石斛堿1.0 mg，定容至100 mL。分別吸取石斛堿標準溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，加氯仿至10.0 mL。加入緩沖溶液(pH 4.5) 5.0 mL 和0.04%溴甲酚綠溶液(加pH 4.5 緩沖溶液溶解，過濾)1.0 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min，用氯仿浸泡處理并用干燥的脫脂棉過濾，取濾液6.0 mL，加0.01 mol·L-1NaOH 無水乙醇溶液1.0 mL，搖勻。以氯仿為空白對照。于波長620 nm 處測定吸光度。標準曲線方程為y=0.0506x+0.1057，R2=0.9938。

1.4.2 樣品制備

取鐵皮石斛花、葉、莖各500 mg，于離心管中用適量氨水浸濕密閉30 min，加10 mL 氯仿，60 ℃水浴2 h，補氯仿至原重。吸取鐵皮石斛花、葉、莖樣液1 mL，稀釋至100 mL，取10 mL 按照1.4.1 測定石斛堿含量。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 水/醇提取物制備

分別稱取鐵皮石斛花、葉、莖50 g，按料液比1:30 加入蒸餾水或95%乙醇，45 ℃水浴提取12 h。提取液離心、抽濾，濾液真空濃縮干燥。

1.5.2 DPPH 自由基清除能力測定

取0.2 mmol·L-1DPPH 乙醇試劑2 mL，置于5 mL 離心管中加入梯度濃度的水提物、醇提物溶液2 mL。靜置 30 min，在517 nm 下檢測吸光度值，記為 AS；以95%乙醇代替DPPH 溶液為本底，記為A1；以95%乙醇代替樣品為空白對照，記為A2。以抗壞血酸為陽性對照。不同梯度濃度樣品的DPPH自由基清除能力按下式計算：DPPH 清除率K(%)=[1-(AS-A1)/A2]×100%。

1.5.3 ABTS 自由基清除能力測定

將1.4 mmol·L-1ABTS 水溶液與0.49 mmol·L-1過硫酸鉀等體積混合后，稀釋至原來4 倍，記為AB液。取2 mL AB 液置于5 mL 離心管中，加入梯度濃度樣品2 mL。靜置6 min，在734 nm 下檢測其吸光度值，記為 AS′；以蒸餾水代替ABTS 溶液為本底，記為A1′；以蒸餾水代替樣液為空白對照，記為A2′；以抗壞血酸為陽性對照。ABTS 清除率K′(%)=[1-(AS′-A1′)/A2′]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛不同部位化學(xué)成分含量

鐵皮石斛不同部位的成分含量差異較大，多糖在鐵皮石斛中的分布情況為：莖>葉>花；黃酮在鐵皮石斛中的分布情況為：花>葉>莖；生物堿在鐵皮石斛中含量均低于0.01%(表1)。多糖為鐵皮石斛的標志性成分，在莖中的含量最高為23.92%；而黃酮在花中含量最高，為1.847%。

表1 鐵皮石斛不同部位化學(xué)成分含量(%)Table 1 Content of chemical constituents in different parts of Dendrobium officinale (%)

2.2 鐵皮石斛不同部位水/醇提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

比較鐵皮石斛花、葉、莖的水提物和乙醇提取物與Vc的DPPH 自由基清除能力。結(jié)果表明，花水提物清除能力最強，其次為莖醇提物、花醇提物，鐵皮石斛花的水提物和醇提物均表現(xiàn)出較強的DPPH 自由基清除能力(圖1)，可能與花中較高的黃酮含量有關(guān)。DPPH 自由基清除能力大小依次為鐵皮石斛花水提物>莖醇提物>花醇提物>葉醇提物>葉水提物>莖水提物，EC50分別為：410.4 μg·mL-1、454.1 μg·mL-1、573.2 μg·mL-1、576.3 μg·mL-1、1049 μg·mL-1、1767 μg·mL-1。

圖1 鐵皮石斛不同部位提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of extracts from different parts of Dendrobium officinale

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

比較鐵皮石斛花、葉、莖的水提物和乙醇提取物與Vc的ABTS 自由基清除能力。結(jié)果表明，莖的醇提物清除能力最強，其次為花水提物和醇提物。石斛花的水提物和醇提物均表現(xiàn)出較強的ABTS 自由基清除能力。鐵皮石斛ABTS 自由基清除能力大小依次為：莖醇提物>花醇提物>花水提物>葉醇提物>莖水提物>葉水提物，EC50分別為61.1 μg·mL-1、62.2 μg·mL-1、103.0 μg·mL-1、157.8 μg·mL-1、427.1 μg·mL-1、464.8 μg·mL-1(圖2)。與DPPH 相比，各組鐵皮石斛水提物對ABTS 的清除能力較強，表明ABTS 清除實驗可以作為測定水溶性物質(zhì)抗氧化能力的指標。

圖2 鐵皮石斛不同部位提取物對ABTS 自由基的清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity of extracts from different parts of Dendrobium officinale

表2 鐵皮石斛提取物自由基清除能力Table 2 Radical scavenging capacity of Dendrobium officinale

3 結(jié)論

石斛屬中的“藥用石斛”為本屬國產(chǎn)種類中具細莖而花小的類群，包括鐵皮石斛、霍山石斛(D.huoshanense)、金釵石斛(D.nobile)等[1]，其中鐵皮石斛知名度較高[2]。張志信等[17]比較鐵皮石斛花、葉、莖的化學(xué)成分含量，發(fā)現(xiàn)莖的多糖含量最高，葉的黃酮類物質(zhì)含量最高，生物堿含量在各部位差異不顯著。

本研究比較鐵皮石斛花、葉、莖中主要成分以及石斛水提取物和乙醇提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，鐵皮石斛莖多糖含量較高，可達23.92%，花中黃酮含量較高，可達1.85%，而生物堿在鐵皮石斛各個部位均較少，在莖中含量僅為0.0086%，可能與石斛品種有關(guān)。在抗氧化活性上，鐵皮石斛不同部位提取物對DPPH 自由基清除能力大小依次為：花水提物>莖醇提物>花醇提物>葉醇提物>葉水提物>莖水提物，EC50分別為 410.4 μg·mL-1、454.1 μg·mL-1、573.2 μg·mL-1、576.3 μg·mL-1、1049 μg·mL-1、1767 μg·mL-1；對ABTS 自由基清除能力大小依次為：莖醇提物>花醇提物>花水提物>葉醇提物>莖水提物>葉水提物，EC50分別為61.1 μg·mL-1、62.2 μg·mL-1、103 μg·mL-1、157.8 μg·mL-1、427.1 μg·mL-1、464.8 μg·mL-1。其中鐵皮石斛莖醇提物表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，但鐵皮石斛花的抗氧化活性整體優(yōu)于葉和莖。