李旭鋒，王 垚，金前躍，周 穩(wěn)，柴永笑，陳 曉，丁培陽(yáng)，張改平,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的雞高度接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為漿膜黏膜出血、呼吸困難、下痢及神經(jīng)紊亂等[1-3]。ND傳播速度快、致死率高、接觸傳染性強(qiáng)、分布廣泛，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疫病[4]。

NDV是副黏病毒科、副黏病毒亞科的腮腺炎病毒屬成員[5]，是具有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。NDV基因組長(zhǎng)約15 kb，包含6個(gè)基因，從3′到5′的順序依次為NP-P-M-F-HN-L，分別編碼核衣殼蛋白(NP蛋白)、磷酸化蛋白(P蛋白)、基質(zhì)蛋白(M蛋白)、融合蛋白(F蛋白)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN蛋白)、RNA聚合酶蛋白(L蛋白)6種結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]。F蛋白和HN蛋白是NDV主要的宿主保護(hù)性抗原，也是決定NDV毒力和致病性的關(guān)鍵因素[8-9]。HN蛋白位于病毒囊膜表面，是兼具血凝素(HA)活性和神經(jīng)氨酸酶(NA)活性的糖基化蛋白[10]，與病毒的附著和宿主免疫反應(yīng)有關(guān)[11]。

在我國(guó)，疫苗接種使ND傳播得到有效控制，但長(zhǎng)期使用滅活疫苗和弱毒苗[12]，容易發(fā)生毒株的變異，以及無(wú)法區(qū)分疫苗免疫和自然感染[13]，給NDV檢測(cè)工作帶來(lái)困難。此外，國(guó)家的中長(zhǎng)期免疫計(jì)劃要求凈化ND，需要研發(fā)更加安全、可靠的ND新型疫苗[14]，而亞單位疫苗便于區(qū)分疫苗免疫和自然感染造成的血清陽(yáng)性，為ND的凈化提供了方便。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，HN蛋白已在大腸桿菌、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物等多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[15-17]。相比之下，酵母細(xì)胞具有生長(zhǎng)速度快、易于遺傳操作、具有真核生物翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的制備[18-19]。鑒于此，使用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)HN蛋白，優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)條件，將重組HN蛋白通過(guò)鎳柱親和層析一步純化，旨在為進(jìn)一步研究NDV HN蛋白亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

重組質(zhì)粒pUC57-HN由上海生工生物工程有限公司合成，pPICZαA、畢赤酵母X-33菌株購(gòu)自Invitrogen公司，大腸桿菌JM109感受態(tài)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

rTaq酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，限制性核酸內(nèi)切酶BsmBⅠ、NotⅠ和PmeⅠ購(gòu)自NEB公司，瓊脂糖凝膠核酸染料Super Gel Red購(gòu)自US Everbright公司，質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司，膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，Ni-NTA填料、HisTrapTMexcel(5 mL)購(gòu)自美國(guó)GE公司，羊抗鼠IgG-HRP二抗、羊抗雞IgG-HRP二抗購(gòu)自Abbkine公司，BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ECL超敏顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，NDV HN單克隆抗體5F2、NDV陰性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒pUC57-HN為模板設(shè)計(jì)引物，上下游分別引入BsmBⅠ和NotⅠ 2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增HN基因片段并回收。將回收HN片段和pPICZαA載體同時(shí)用BsmBⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切后回收，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pPICZαA-HN酵母表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)后，將菌液均勻涂布在LLB(Zeocin 30 μg/mL)平板，37 ℃搖床(220 r/min)過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定并送公司測(cè)序。

1.4 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆鑒定

將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液按1∶1 000接種到250 mL LLB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床(220 r/min)過(guò)夜培養(yǎng)，按質(zhì)粒中提試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度。質(zhì)粒用PmeⅠ酶單酶切后回收，經(jīng)測(cè)定其質(zhì)量為6.9 μg，達(dá)到電轉(zhuǎn)要求。將回收的質(zhì)粒和X-33感受態(tài)混勻，加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上靜置5 min，按照電壓1.5 kV、電容25 μF、電阻200 Ω、電擊時(shí)間4.7 ms的程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后迅速加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中30 ℃培養(yǎng)2 h。然后取適量細(xì)胞懸液均勻地涂布到Y(jié)PD(Zeocin 100 μg/mL)平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d。

挑取YPD平板上10個(gè)單克隆分別接種到5 mL YPD培養(yǎng)基中，編號(hào)1—10，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。各取1 mL菌液離心，菌體用NaOH(0.5 mol/L)處理，7 000 r/min離心后棄上清。用雙蒸水重懸，離心棄上清，重復(fù)一次。沉淀中加入50 μL雙蒸水重懸，沸水煮10 min后離心，取1 μL上清作為PCR模板，進(jìn)行PCR鑒定。

對(duì)輸電線路實(shí)施監(jiān)控,實(shí)時(shí)掌握輸電線路的各種運(yùn)行參數(shù)是實(shí)現(xiàn)電力設(shè)備狀態(tài)檢修的前提,也是建設(shè)智能電網(wǎng)的一個(gè)重要組成部分。大多數(shù)輸配電設(shè)備地處偏遠(yuǎn),工作環(huán)境惡劣,檢修設(shè)備的供電問(wèn)題難以解決,特別是夜間照明設(shè)備是很難解決的問(wèn)題。因此為電網(wǎng)檢修設(shè)備設(shè)計(jì)高性能供電電源問(wèn)題很有必要[1-2]。

1.5 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

PCR鑒定陽(yáng)性菌液按1∶10接種于BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)24 h，將BMGY中菌液按1∶5接種至BMMY培養(yǎng)基中，并每天加入1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。

誘導(dǎo)第3天，各取2 mL菌液離心取上清，加入20 μL鎳填料，4 ℃過(guò)夜孵育。離心棄上清，沉淀中加入100 μL 500 mmol/L咪唑(Imidazole)重懸，離心(12 000 r/min)取上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。

采用半干法轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的PBST溶液4 ℃過(guò)夜孵育。一抗為1∶1 000稀釋的5F2單抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，二抗為1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，ECL顯色液顯色。

1.6 蛋白質(zhì)表達(dá)條件的優(yōu)化

畢赤酵母作為外源重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH值、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件均會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)量，因此對(duì)上述條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高HN蛋白的表達(dá)量。

1.6.1 誘導(dǎo)劑含量 甲醇含量大于3.0%會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，分別用終含量為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，在第3天收取上清，用Dot blot進(jìn)行分析。

1.6.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH值 畢赤酵母生長(zhǎng)的pH值范圍為3.0～8.0，試驗(yàn)中培養(yǎng)基的初始pH值分別設(shè)置為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d收取上清，進(jìn)行Dot blot分析。

1.6.4 誘導(dǎo)時(shí)間 畢赤酵母培養(yǎng)時(shí)間一般為3～5 d，試驗(yàn)中從第1天開(kāi)始每天收取上清，收取6 d，進(jìn)行Dot blot分析。

Dot blot操作步驟：取NC膜，用96孔板壓出印跡，每個(gè)點(diǎn)按5 μL上清點(diǎn)樣，將膜烘干后，用含5%脫脂奶粉的PBST溶液4 ℃過(guò)夜孵育。一抗為1∶1 000稀釋的5F2單抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，二抗為1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，ECL顯色液顯色，通過(guò)顯色強(qiáng)弱及灰度掃描進(jìn)行結(jié)果判定。

1.7 蛋白質(zhì)純化

按1.6中研究出的最適條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌液8 000 r/min離心30 min，取上清用0.45 μm濾膜抽濾。采用HisTrapTMexcel(5 mL)預(yù)裝柱進(jìn)行純化，先用雙蒸水沖洗柱子，再用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、pH值 8.0)平衡柱子，然后用蠕動(dòng)泵上樣，流速設(shè)為1.5 mL/min。上樣結(jié)束后用AKTA pure純化儀進(jìn)行純化，用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、pH值 8.0)和洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、500 mmol/L Imidazole、pH值8.0)為母液設(shè)置梯度，摸索最佳純化條件。并用SDS-PAGE和Western blot鑒定。最后用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度后，-80 ℃分裝保存。

1.8 蛋白質(zhì)活性鑒定

將純化蛋白包被酶標(biāo)板(10 μg/孔)，含5%脫脂奶粉的PBST溶液4 ℃過(guò)夜孵育，一抗加入倍比稀釋的NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)陰性血清對(duì)照，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，二抗為1∶1 000稀釋的羊抗雞IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，PBST洗5遍，顯色后酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。

1.9 蛋白質(zhì)糖基化分析

取適量純化蛋白，按PNGase F酶切說(shuō)明操作，37 ℃酶切1 h后Western blot鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定

將HN基因片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接至pPICZαA載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，PCR鑒定為陽(yáng)性(圖1)，菌液測(cè)序結(jié)果正確，表明pPICZαA-HN表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 酵母單克隆PCR鑒定

挑取的酵母單克隆經(jīng)處理后，PCR鑒定結(jié)果顯示,5株單克隆呈陽(yáng)性(圖2)。可見(jiàn)，目的片段成功整合至酵母基因組，可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 HN蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

取鎳填料富集的上清80 μL加入20 μL 5×Loading Buffer，沸水煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE(圖3)和Western blot(圖4)鑒定，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)條帶大小正確，能被NDV HN單克隆抗體5F2特異性識(shí)別，由此表明，HN蛋白在畢赤酵母X-33中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，且表達(dá)蛋白抗原性良好。

M:DL2000;1—4:單克隆菌落;5:陰性對(duì)照M:DL2000;1—4:The single colony strains;5:Negative control圖1 pPICZαA-HN載體PCR鑒定Fig.1 Identification of pPICZαA-HN by PCR

M:DL2000;1—7:單克隆菌落;8:陽(yáng)性對(duì)照;9:陰性對(duì)照M:DL2000;1—7:Single colony strains;8:Positive control;9:Negative control圖2 酵母菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of yeast colony strains by PCR

M:蛋白質(zhì)Marker;1:空載體;2:未誘導(dǎo);3—7:陽(yáng)性克隆M:Protein Marker;1:Empty vector;2:Not induced;3—7:Positive clones圖3 SDS-PAGE檢測(cè)HN蛋白表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE to detect HN protein expression

M:蛋白質(zhì)Marker;1:空載體;2:未誘導(dǎo);3—7:陽(yáng)性克隆M:Protein Marker;1:Empty vector;2:Not induced;3—7:Positive clones圖4 Western blot 檢測(cè)HN蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot to confirm the positive clones expressed HN protein

2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)劑含量 如圖5所示，當(dāng)甲醇含量為0.5%時(shí)，顯色最亮，且1∶32稀釋時(shí)仍有顯色；當(dāng)甲醇含量大于2%時(shí)，顯色明顯變?nèi)?。故本試?yàn)中HN蛋白表達(dá)的最適甲醇含量為0.5%。

圖5 不同甲醇含量誘導(dǎo)表達(dá)效果Fig.5 Expression results of different content of methanol

2.4.2 誘導(dǎo)時(shí)間 如圖6所示，隨誘導(dǎo)時(shí)間遞增，顯色增強(qiáng)，說(shuō)明HN蛋白表達(dá)量增加，但第5天和第6天沒(méi)有明顯差異，而隨著誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)雜蛋白和代謝產(chǎn)物增多，不利于目的蛋白的純化，故本試驗(yàn)選擇的誘導(dǎo)時(shí)間是5 d。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)效果Fig.6 Expression results of different induction time

2.4.3 培養(yǎng)基初始pH值 如圖7所示，HN蛋白在pH值3.0～8.0均能表達(dá)，而pH值為7.0時(shí)顯色最亮，故本試驗(yàn)中HN蛋白表達(dá)的最適培養(yǎng)基初始pH值為7.0。

圖7 不同培養(yǎng)基初始pH值表達(dá)效果Fig.7 Expression results of different initial pH value of culture medium

2.4.4 誘導(dǎo)溫度 如圖8所示，誘導(dǎo)溫度在28 ℃時(shí)顯色較亮，但相比其他溫度差異不明顯，說(shuō)明溫度對(duì)HN蛋白表達(dá)量影響較小，同時(shí)畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28～30 ℃，故本試驗(yàn)中HN蛋白表達(dá)選用28 ℃。

圖8 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)效果Fig.8 Expression results of different temperature

上述結(jié)果表明，在28 ℃條件下，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，用0.5%甲醇誘導(dǎo)5 d，為重組HN蛋白的最佳表達(dá)條件。

2.5 蛋白質(zhì)純化

采用AKTA pure純化儀純化目的蛋白，以20 mmol/L咪唑洗雜蛋白，200 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖9A)，經(jīng)鎳柱純化的目的蛋白純度達(dá)到90%以上，Western blot驗(yàn)證洗脫峰為HN蛋白(圖9B)。純化的HN蛋白經(jīng)BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，其產(chǎn)量可達(dá)25 mg/L。

A:SDS-PAGE分析;B:Western blot分析；M:蛋白質(zhì)Marker;1:流穿液;2:洗脫峰；A:SDS-PAGE analysis;B:Western blot analysis;M:Protein Marker;1:Flow-through fluid;2:Elution peak圖9 重組HN蛋白SDS-PAGE和Western blot分析Fig.9 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified recombinant HN protein

2.6 蛋白質(zhì)活性分析

純化的HN蛋白進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，HN蛋白與NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)性良好，當(dāng)血清1∶12 800稀釋時(shí)，與陰性對(duì)照依然存在差異(圖10)，表明純化后HN蛋白活性良好。

2.7 蛋白質(zhì)糖基化分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖11)，目的蛋白經(jīng)PNGase F處理后，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小約為63 ku，說(shuō)明表達(dá)的HN蛋白有N-糖基化修飾，證明重組HN蛋白分子質(zhì)量偏大和拖帶的原因?yàn)樘腔?/p>

圖10 重組HN蛋白間接ELISA檢測(cè)Fig.10 Indirect ELISA detection of recombinant HN protein

M:蛋白質(zhì)Marker;1:未處理;2:PNGase F酶切處理M:Protein Marker;1:No treatment;2:PNGase F deglycosylation treatment圖11 Western blot分析HN蛋白糖基化Fig.11 Analysis of the glycosylation of HN protein by Western blot

3 結(jié)論與討論

HN蛋白作為NDV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，由于其良好的免疫原性，一直是ND亞單位疫苗研究的熱點(diǎn)。MOHAN等[15]在大腸桿菌中成功表達(dá)了HN蛋白，但原核宿主不能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后糖基化修飾，影響了HN蛋白活性。LEE 等[16]通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了HN蛋白，具有良好的免疫原性，但未能進(jìn)行高密度培養(yǎng)。蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的異源表達(dá)，形成了具有天然構(gòu)象的重組蛋白，但價(jià)格昂貴，生產(chǎn)水平較低。相比之下，酵母表達(dá)體系具有真核生物翻譯后修飾特點(diǎn)，且酵母細(xì)胞具有快速生長(zhǎng)的能力，易于遺傳操作[18]，可進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，成本較低。因此，酵母表達(dá)系統(tǒng)作為外源蛋白表達(dá)體系在亞單位疫苗研制中具有明顯優(yōu)勢(shì)[19-20]。

本研究構(gòu)建了pPICZαA-HN載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33后，成功表達(dá)了糖基化修飾的HN蛋白。利用Dot blot對(duì)誘導(dǎo)上清直接進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化了表達(dá)條件，最終結(jié)果顯示，在28 ℃條件下，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，用0.5%甲醇誘導(dǎo)5 d，蛋白質(zhì)表達(dá)量較高，產(chǎn)量可達(dá)25 mg/L。同時(shí)，表達(dá)的HN蛋白帶有His標(biāo)簽，經(jīng)鎳柱親和層析一步純化，即可得到純度大于90%的HN蛋白。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，純化蛋白能與NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清特異性反應(yīng)，表明其活性良好。HN蛋白是糖基化蛋白，試驗(yàn)中目的蛋白比預(yù)測(cè)分子質(zhì)量偏大，推測(cè)是糖基化導(dǎo)致。為驗(yàn)證推測(cè)，使用PNGase F去糖基化酶切后，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值相符，說(shuō)明重組HN蛋白存在糖基化修飾。而糖基化修飾對(duì)HN蛋白的活性以及免疫原性的影響情況，還需進(jìn)一步研究。

綜上，HN蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)，且活性良好具有糖基化修飾，經(jīng)鎳柱親和層析一步純化，即可獲得高純度的目的蛋白，表達(dá)條件經(jīng)優(yōu)化可顯著提高目的蛋白的產(chǎn)量。