朱 靈， 張夢瑤， 高永恒,2

(1.中國科學院 水利部成都山地災害與環(huán)境研究所， 四川 成都 610041； 2.中國科學院 成都生物研究所， 四川 成都 610041)

草原生態(tài)系統(tǒng)是全球面積最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)，全球草原生態(tài)系統(tǒng)碳儲量約1.20×1015kg C，其中90%以上碳儲存在土壤中[1]。全球變化背景下，降雨量與氮沉降呈上升趨勢[2-3]，降水和氮沉降變化會通過影響土壤的化學性質(zhì)、微生物、酶活性等而影響土壤有機碳礦化過程。截止目前在溫帶或者低海拔地區(qū)開展了不少有關(guān)水氮變化對土壤碳礦化影響的研究[4]，主要有促進、抑制以及無顯著影響3種結(jié)論[5-7]。氮沉降和降水變化主要通過提高土壤中的微生物量、土壤碳分解酶的活性等促進碳礦化[5]，或造成土壤有機碳周轉(zhuǎn)減慢、土壤酸化等抑制碳礦化[6]。高海拔寒冷地區(qū)的高寒草原對氣候變化響應(yīng)敏感[8]，但土壤碳礦化對水氮變化的響應(yīng)研究較少。

青藏高原作為全球最高的地理單位正經(jīng)歷著降水變化和氮沉降增加的影響，研究預測到2050年青藏高原氮沉降量將達到40 kg/(hm2·a)[9]；為期55 a的降水觀測也表明青藏高原主體部分年降水量以6.24 mm/10 a的傾向率增多[10]。高寒草原作為青藏高原的重要組成部分，對氣候變化響應(yīng)敏感，但土壤碳礦化的研究多關(guān)注對單一氮添加和溫度變化的響應(yīng)[11]，對水氮添加的響應(yīng)研究較少。本研究通過對藏北高寒草原土壤進行室內(nèi)模擬水氮添加，研究高寒草原土壤有機碳礦化的變化，并分析水氮添加后土壤酶活性、土壤碳的變化，為深入認識氮沉降增加和降水變化情形下青藏高原高寒草原土壤碳礦化的響應(yīng)過程和機理提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本次試驗研究區(qū)在西藏自治區(qū)那曲地區(qū)申扎縣境內(nèi)(30°57′N，88°42′E)，海拔4 675 m。研究區(qū)氣候?qū)儆诟咴瓉喓畮Ц珊导撅L性氣候，寒冷干燥。年均氣溫0℃左右，最低溫1月份的平均氣溫為-10.1 ℃，高溫期7月份的平均氣溫為9.6 ℃。年降雨量為300 mm，降水主要集中在5—9月。紫外輻射強度大，年均太陽輻射為2 915.5 h，霜期持續(xù) 279.1 d。研究區(qū)植被類型以高寒草原為主，植被蓋度約為40%，群落優(yōu)勢種為多年生禾草紫花針茅(Stipapurpurea)和青藏苔草(Carexmoorcrofii)[12]。本文選用圍封5 a的草原作為試驗地，根據(jù)中國土壤系統(tǒng)分類方法，試驗地土壤主要為寒性旱成土，表層土壤包含91%的砂質(zhì)土，7%的泥沙和2%的黏土，0—10 cm土壤中有機碳和全氮的含量分別為62.05 g/kg與3.13 g/kg，pH=8.43[13]。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及處理 2017年6月在樣地選取空間上地形一致、土壤條件相似的3處10 m×10 m的大樣方，按照簡單隨機抽樣的原則，在大樣方內(nèi)在隨機設(shè)置3個1 m×1 m的小樣方。清除小樣方土壤表面植被凋落物層后，用鐵鍬取0—15 cm土壤并清除土壤中肉眼可見雜物，再把每個大樣方里3個土樣混合均勻，3個大樣方共計得到3個土樣，4 ℃保存在便攜式冰箱里盡快送回實驗室。在實驗室里過2 mm土壤篩后放至通風處自然風干，另取一部分過篩土用研缽磨細后過0.149 mm的土壤篩測定土壤理化性質(zhì)。

1.2.2 土壤基本性質(zhì)測定 采用下述方法測定田間水量(WHC)，用取10 g土壤，置于覆有濾紙的漏斗中，用合適的橡膠塞堵塞漏斗的長頸口，添加足夠的水將漏斗內(nèi)的土壤全部浸泡。浸泡2 h后，取走漏斗長頸口的橡膠塞，讓水分自由滴下。保持水分的自由滴流8 h后，取出漏斗內(nèi)的濕土放置于鋁盒中，記錄濕土和鋁盒的總重量，再把裝有濕土的鋁盒置于105 ℃的烘箱中烘干8 h至恒重，再取出鋁盒迅速測量干土和鋁盒總重量；土壤pH值用pH計測定(水∶干土=5∶1)；溶解性有機碳(DOC)采用TOC5000儀測定[14]；土壤微生物生物量碳(MBC)、土壤微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸法測定[15]；土壤脲酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性用土壤酶 ELISA 試劑盒測定[16]。

1.2.3 培養(yǎng)試驗設(shè)計 預培養(yǎng)保持土壤含水量在田間持水的40%，取過2 mm土壤篩的自然風干土100 g，放入250 ml三角瓶中，水分換算后把水均勻噴灑于瓶中風干土上。土壤培養(yǎng)溫度設(shè)置為20 ℃，等于土樣采集時野外原位土壤溫度，首先進行連續(xù)7 d的預培養(yǎng)，以恢復土壤微生物活性[17]，接著進行連續(xù)90 d的培養(yǎng)試驗。在培養(yǎng)期間，通過稱重法給土壤補水以保持40%的田間持水量[18]。為了探索不同土壤水分條件下微生物的代謝性能，本試驗共設(shè)置45%,60%,75 %和90% 4個水分梯度。預培養(yǎng)的土壤含水量為40%WHC，預培養(yǎng)結(jié)束后，在40%WHC的基礎(chǔ)上通過稱重法進行水分的補給，以達到培養(yǎng)期間45%,60%,75 %,90%WHC 4個水分條件。水分添加后，把所有三角瓶于黑暗環(huán)境置于20 ℃的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加氮。每個水分梯度處理下分別以NH4NO3水溶液的形式輸入無機氮肥，1個對照(0 mg/g)和3個氮添加梯度(0.2,0.4,0.8 mg/g)，文中記為N0,N0.2,N0.4,N0.8。N0.2處理接近當?shù)夭菰┓柿?，結(jié)合高寒草原土壤最大氮載荷，設(shè)置N0.4,N0.8處理以探究低氮和高氮添加對高寒草原土壤碳礦化的影響，不同氮添加下各3個重復。經(jīng)換算室內(nèi)培養(yǎng)氮添加量分別等同于0,2.5,5,10 g/(m2/a)(以N計)的田間添加量。

1.2.4 CO2排放通量的測定 在培養(yǎng)后第 1，3，8，15，22，29，36，43，50，60，70，80，90 d測定土壤的CO2排放量，培養(yǎng)第1,45,90 d分別為培養(yǎng)初、中、末期。測定前用橡膠塞密封培養(yǎng)瓶2 h，用注射器連通三通閥抽取20 ml氣體，用氣相色譜儀分析CO2濃度，用來表示土壤微生物呼吸強度。CO2的通量單位為mg/kg·h，CO2的通量F的計算公式為：

式中：ρ為CO2在標準狀態(tài)下氣體的密度，為1.965 kg/m3；V為培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體的有效體積(m3)； ΔC為氣體濃度差(1 mg/L)；m為培養(yǎng)土烘干重(kg)； Δt為培養(yǎng)時間(h)；T為進氣時的室溫(℃)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗地土壤視為同一土壤類型，水氮添加對土壤碳礦化的影響采用SPSS 21.0進行雙因素方差分析和Pearson相關(guān)性分析，不同梯度的水或者氮處理之間用最小顯著差異(LSD法，p<0.05)進行檢驗，圖形繪制使用Origin 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤有機碳礦化對水氮添加的響應(yīng)

培養(yǎng)初期(圖1a)，45%WHC與60%WHC條件下，隨著氮添加的增高，土壤CO2排放通量呈上升趨勢，但在75%，90%WHC高水分條件下，土壤CO2排放通量明顯下降。在此階段，水氮交互作用對土壤有機碳礦化有顯著影響。培養(yǎng)中期(圖1b)，CO2累積排放通量占整個培養(yǎng)期間的53.42%～60.59%，這是由于在這段期間內(nèi)土壤中微生物的活性較高。培養(yǎng)末期(圖1c)，在最接近土壤原始水分含量下(45%WHC)，高氮添加抑制了土壤碳礦化。雖然水氮交互作用對土壤有機碳礦化在統(tǒng)計學上沒有達到顯著影響，但在90%WHC水分添加下緩解了高氮添加對土壤礦化過程的抑制作用，60%，75%WHC條件下氮添加促進土壤碳礦化過程。

注：①圖中不同小寫字母表示差異顯著，p0,N0.2,N0.4,N0.8表示氮添加梯度，氮添加量分別為0，0.2,0.4,0.8 mg/g。下同。

2.2 土壤溶解性有機碳的變化

培養(yǎng)初期(圖2a)，45%，60%，75%WHC條件下，N0.2，N0.4低氮處理下土壤DOC含量與對照沒有顯著差異。45%WHC水分條件下，隨著施氮量增加，土壤DOC含量呈上升趨勢，高氮添加有利于土壤DOC的積累。但在60%，75%，90%WHC水分條件下，未表現(xiàn)出土壤DOC含量隨施氮的增加而上升。培養(yǎng)中期，水氮交互作用對DOC含量有顯著影響。在中期與末期階段(圖2b，2c)，90%WHC高水分條件下的 DOC含量始終顯著高于其余 3個水分狀態(tài)(p<0.05)，土壤DOC含量受水分添加的影響更敏感，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 不同培養(yǎng)階段土壤溶解性有機碳(DOC)動態(tài)變化

2.3 土壤微生物量碳、氮的變化

培養(yǎng)初期水氮添加對土壤MBC含量均有顯著影響(見表1)，不同水平氮添加下，土壤微生物量碳含量隨著水分含量的增多不同程度上升(見表2)。氮添加對土壤MBC含量也有顯著影響，同一水分條件下，N0.2處理較N0處理下的土壤MBC含量高，N0.4，N0.8較N0處理下的土壤MBC含量低。4個不同水分條件下，最低MBC含量均出現(xiàn)在N0.8處理下，說明氮添加超過一定閾值后，會造成土壤MBC含量下降。中期水分對土壤MBC含量有顯著影響，氮添加與水氮交互作用對其影響不顯著(見表2)。45%，60%，75%WHC的水分條件下，不同水平水氮添加后，土壤MBC含量較培養(yǎng)初期時有所上升，只有個別處理土壤MBC含量下降(W45%+N0.2和W60%+N0.2)。90%WHC的水分條件下，4個不同水平氮添加后，中期的土壤MBC含量反而均低于培養(yǎng)初期。從培養(yǎng)的初、中、末3個階段里的土壤MBC峰值來看，在為期90 d的培養(yǎng)中，土壤MBC含量先上升再下降。

表1 不同培養(yǎng)階段土壤微生物生物量碳和土壤微生物生物量氮對水氮添加的響應(yīng)

注：①表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在相同培養(yǎng)時間下土壤微生物生物量碳MBC，土壤微生物生物量氮MBN含量差異顯著，p<0.05; ②表中N0,N0.2,N0.4,N0.8表示氮添加梯度,氮添加量分別為0,0.2,0.4,0.8 mg/g; ③W45%,W60%,W75%,W90%表示4個水分梯度,為土壤田間持水量為45%,60%,75%和90%。下同。

培養(yǎng)初期，與N0處理相比，N0.8處理降低土壤MBN含量，但高氮對土壤MBN含量的負作用在高水分條件下得到緩解。培養(yǎng)中期，水氮交互作用對土壤MBN含量影響更加明顯，75%WHC與90%WHC下，均是N0.8處理下土壤MBN含量達到最大。3個階段里土壤MBN峰值先上升再下降，總體上看土壤MBN含量較穩(wěn)定，不同處理下差異較小。

2.4 土壤酶活性變化

在培養(yǎng)初期時(圖3a,3d,3g)，4個不同的水分條件下，與土壤原始含氮量相比，高氮處理后，土壤脲酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶活性均降低，相比于45%WHC條件下，隨著水分的添加，高氮處理對3種酶活的抑制得到不同程度的緩解。在培養(yǎng)中期，總體來看，除90%WHC條件下，其他不同水氮處理下的土壤脲酶活性均較培養(yǎng)第1 d有上升(圖3b)。土壤蔗糖酶活性對水分添加更敏感，與未進行氮添加處理的蔗糖酶活性相比，45%，60%，75%WHC下不同水分氮添加處理后，土壤蔗糖酶活性上升(圖3e)，這與初期時均是未對土壤進行施氮處理下的土壤蔗糖酶活性最大有較大改變。培養(yǎng)末期(圖3c,3f,3i)，不同水氮處理下的脲酶活性均比第45 d時低，蔗糖酶活性,β-葡萄糖苷酶活性總體呈降低趨勢，高氮添加抑制酶活性更加明顯。

圖3 不同培養(yǎng)階段土壤酶活性的動態(tài)變化

2.5 CO2排放通量與土壤溶解性有機碳、土壤微生物生物量碳及酶活的相關(guān)分析

土壤DOC含量與CO2累積排放通量在培養(yǎng)初期呈正相關(guān)(R=0.017，p=0.476，見表3)，隨著培養(yǎng)的進行，在中、末期呈顯著負相關(guān)關(guān)系(R=-0.616，p=0.006；R=-0.820，p<0.001)，這說明隨著水氮的添加，雖然緩解了研究區(qū)干旱、氮素不足的情況，土壤DOC含量呈上升趨勢，但DOC生物可利用性降低。土壤MBC含量與CO2累積排放通量關(guān)系在統(tǒng)計學意義上雖然沒達到顯著，但是隨著培養(yǎng)時間的進行，土壤MBC含量的增加有利于有機碳礦化過程的進行。在初期，土壤脲酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶與CO2累積排放通量均呈負相關(guān)關(guān)系(R=-0.319，p=0.114；R=-0.275，p=0.151；R=-0.229，p=0.197)，這說明在初期適宜的水氮添加雖然提高了酶活性，但由于研究區(qū)受有機質(zhì)不足等的限制，所以CO2排放通量未表現(xiàn)出隨著土壤酶活的上升而增加。在培養(yǎng)中期，水氮添加緩解了水分不足、營養(yǎng)匱乏下的限制作用，促進土壤中有機物質(zhì)的溶解，提高了參與土壤碳礦化相關(guān)微生物的活性，CO2排放通量與土壤酶活表現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系，中期CO2累積排放通量達到了整個培養(yǎng)期間的53.42%～60.59%。

表3 CO2累積排放通量與土壤指標的Pearson相關(guān)性分析

注：①表中數(shù)值為Pearson相關(guān)系數(shù)，記為R; ②*表示在置信度(單側(cè))為0.05時，相關(guān)性顯著**表示在置信度(單側(cè))為0.01時，相關(guān)性極顯著。

3 討 論

3.1 土壤有機碳礦化

在培養(yǎng)初期，N0.4，N0.8高氮添加處理下的CO2排放通量高于N0，N0.2低氮添加下的CO2排放通量，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，氮素添加反而抑制了土壤有機碳礦化過程，這是由于在初期，土壤中碳源充足，且研究區(qū)土壤原始含氮量較低，易氧化分解的物質(zhì)受氮素限制[19]，所以當外加氮源后，提高了原本受氮素限制的微生物活性及其相關(guān)酶活[20-21]，表現(xiàn)為氮添加促進土壤有機碳礦化過程。隨著培養(yǎng)的進行，土壤中可利用碳源的降低，且有研究表明，高氮添加增加了有機物的芳香性和復雜性[22]，導致微生物碳源受限制；此外，氮添加增加了土壤氮的有效性，增加了離子強度并降低了土壤pH值[23]，降低了土壤酶活性，表現(xiàn)為累積CO2排放通量的降低。

在培養(yǎng)初期，水氮交互作用對土壤碳礦化有顯著影響，在中期和末期，隨著水分含量的增加可以有效減緩高氮添加對土壤碳礦化的抑制作用。這是由于水分對土壤有機碳礦化的影響主要是通過改變土壤通透性來實現(xiàn)，土壤碳礦化作用是一個需氧過程，在接近土壤原始水分條件下(本研究區(qū)為45%WHC)，高氮對土壤微生物量、土壤酶活等的抑制作用更容易表現(xiàn)出來。也就說，當水分條件不是土壤碳礦化作用的限值因素時，其他影響土壤碳礦化作用的因素才容易表現(xiàn)出來，這與其他研究結(jié)果一致[19,24]。當水分過高時，土壤處于厭氧環(huán)境，土壤含氧量成為土壤碳礦化過程的主要調(diào)控因子，高氮添加的抑制作用受阻，對外表現(xiàn)為高水分添加減緩了高氮添加對土壤有機碳礦化的抑制作用。以上結(jié)果說明，土壤碳礦化過程對水分添加的響應(yīng)更敏感，氮添加對土壤碳礦化作用的影響依賴于水分添加。

3.2 土壤溶解性有機碳

土壤DOC含量與土壤有機碳礦化相關(guān)[25-26]，容易受土壤理化性質(zhì)影響，如土壤水分、pH值、溫度等。在適宜的水分添加會加速土壤中可溶性有機物質(zhì)的溶解，并且研究表明土壤中的團聚體在高土壤含水量狀態(tài)下發(fā)生裂解釋放出被礦質(zhì)土壤吸附的有機物質(zhì)[27]，此外，DOC是土壤微生物容易利用的碳源，在高水分條件下微生物活性降低，利用DOC能力下降，這也就解釋了本次研究中90%WHC下 DOC含量高于其余3個水分下DOC 含量。本研究表明，與培養(yǎng)第1 d未添加氮的土壤DOC含量相比，在不同時期里，不同氮量添加后土壤DOC含量均上升，這是由于本研究中的土壤原始含氮量較低，低氮添加加速了土壤腐殖化進程[28]，也促進了土壤中的根系分泌物如碳水化合物、氨基酸等和微生物的代謝產(chǎn)物的降解作用，從而使得土壤中的 DOC 含量有所增加；高氮添加抑制木質(zhì)素降解真菌的活性，增加水溶性產(chǎn)物的釋放[29]，且高氮刺激一些木質(zhì)纖維素放線菌的活性，其代謝產(chǎn)生可溶性多酚[30]，增加土壤DOC含量。

在培養(yǎng)中、后期，土壤碳礦化與土壤DOC含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系，這可能與土壤水分的影響以及土壤性質(zhì)改變有關(guān)。高水分條件下，土壤通透性下降，氮添加造成土壤pH降低，這些都影響土壤酶活、土壤微生物數(shù)量、活性等；此外，也說明雖然水氮添加后土壤DOC含量上升，但微生物可利用的DOC卻減少，例如上述提到的多酚類物質(zhì)。

3.3 土壤微生物量碳、氮

3.4 土壤酶活性

本次研究中的土壤采自受水分和氮素含量限制的區(qū)域，適宜的水分條件下(干旱地為45%～75%)進行低氮添加提高了土壤脲酶活性。這是由于水氮添加緩解了水分不足、營養(yǎng)匱乏下的限制作用，促進土壤中有機物質(zhì)的溶解，提高了參與土壤碳礦化相關(guān)微生物的活性，酶活性也隨之增加。且施氮肥為土壤脲酶的酶促反應(yīng)提供了大量的基質(zhì)，刺激了土壤脲酶活性[35]，這也就解釋了與土壤原始含氮量相比，一定程度的氮肥添加可以提高脲酶活性。在培養(yǎng)的中、后期，隨著水分含量的增加，蔗糖酶活性呈降低趨勢，這說明當土壤水分含量較高時，土壤通透性降低導致孔隙度下降而抑制了土壤蔗糖酶活性，與脲酶相比，蔗糖酶對水分添加的響應(yīng)更加敏感?？偟膩碚f，適宜的水氮添加下，土壤酶活性呈增強趨勢，這是由于水分可以促進氮素有效性。特別是在高寒草原地區(qū)，水氮是重要的限值因素，適宜的添加，提高了微生物活性及酶活。當土壤水分含量超過田間最大持水量的75%，通透性下降，且高氮添加土壤中氮達到飽和后，鹽基離子損耗，土壤酸化[23]，從而降低了酶活性。

4 結(jié) 論

(1) 在45%～75%WHC水分條件下，低氮添加(<0.4 mg/g)(以N計)促進了微生物對碳底物的代謝活性和利用，提高了土壤的碳礦化能力。45%WHC條件下高氮添加(>0.8 mg/g)抑制土壤有機碳礦化過程。

(2) 土壤碳礦化受水分調(diào)控更加敏感。水氮存在交互作用，氮添加對土壤碳礦化作用的影響依賴于水分添加，高水分處理(>90%WHC)可以緩解高氮添加對土壤碳礦化的抑制作用。

(3) 研究區(qū)土壤碳礦化的最適水分條件為60%WHC，最適氮添加量為0.2 mg/g(以N計)，水分含量與氮添加閾值分別為75%WHC與0.4 mg/g，超過閾值便會抑制土壤碳礦化。