程龍，彭豐，李晉南，徐奇友，王連生

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海2 013063）

堿度為重要環(huán)境指標，顯著影響魚類的生長。魚類對堿度的耐受具有一定范圍，高碳酸鹽堿水環(huán)境對魚類有毒害作用[1]。Galat 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，隨著堿度的增加，鮭鰓上皮細胞分離或破裂，氯細胞增生肥大，腎小球突起及腎小球或造血組織中出現(xiàn)無色透明小液滴等癥狀。王萍等[3]分析了青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 堿脅迫后腸的排泄物，發(fā)現(xiàn)鹽度、堿度及湖水脅迫等均可引起腸道大量排出HCO3-離子，表明腸道在調(diào)節(jié)裸鯉體內(nèi)滲透壓中具有重要意義。但堿脅迫對魚類腸道形態(tài)的影響還沒有相關(guān)的研究。堿度過高顯著影響魚類消化酶的活性，水環(huán)境堿度過高一般會降低魚類的消化酶活性和攝食水平、餌料利用率及生長。袁玉仁[4]研究表明，堿度高于10mmol/L 時花鱸Lateolabrax japonicus 消化酶活性明顯降低；隨著堿度的升高以及試驗時間的延長，對花鱸消化酶活性的降低程度更為明顯。主要原因是水環(huán)境堿度的提高使消化道pH升高，當pH 超過消化酶最適區(qū)域時，消化酶的活性下降[5]。

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）是生物體三羧酸循環(huán)中連接碳代謝和氮代謝的重要中間產(chǎn)物[6]，也是合成谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等氨基酸的前體。目前，AKG 對仔豬[7,8]、肉仔雞[9]以及雜交鱘[10]等動物生長、腸道發(fā)育和腸道抗氧化能力等已有大量研究，表明AKG 在促進陸生或水產(chǎn)動物受損腸道的修復，保持腸道組織形態(tài)完整性中起重要作用。李晉南等[11]研究表明，AKG 可以明顯提高松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu 腸道肌層厚度以及皺襞高度，明顯增強腸道消化酶的活性。但在飼料中添加AKG 能否有效降低堿度脅迫對魚類消化系統(tǒng)的影響還沒有研究。本試驗在不同堿度水環(huán)境下，給松浦鏡鯉分別投喂含有1%AKG 和不含AKG的飼料，以探究不同堿度條件下松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能變化，及水體堿度與飼料中AKG 的添加對松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響，為鹽堿水養(yǎng)殖實踐中AKG 的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

AKG（純度≥98.0%）購自Sigma 公司；松浦鏡鯉幼魚購自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。

根據(jù)《鯉魚配合飼料》（SC/T 1026-2002）以及NRC（2011）要求，以進口蒸汽魚粉及豆粕為蛋白質(zhì)源，以豆油、魚油、大豆磷脂為脂肪源，配制等氮等能基礎(chǔ)飼料（表1）。用AKG 替代基礎(chǔ)飼料中的葡萄糖，配制成含有1%AKG 和不含AKG 的2 種試驗飼料。飼料原料粉碎后過80 目篩，按表1 配方稱重后將各原料逐級混合均勻，加入一定量的水，充分混勻后經(jīng)小型制粒機加工成粒徑為1mm 的顆粒飼料，常溫風干后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及飼養(yǎng)管理

本研究，養(yǎng)殖水體共設(shè)15mmol/L 和30mmol/L 2個碳酸鹽堿度和1 個淡水對照組（0mmol/L），每個處理組3 個平行。用NaHCO3（分析純）配置相應(yīng)的堿度，用0.02mol/L 的鹽酸標定，甲基橙-苯胺藍（混合）和酚酞作指示劑[12]，實測堿度分別為14.85 mmol/L和29.22mmol/L。

養(yǎng)殖試驗前徹底清理魚缸并消毒。實驗魚用4%食鹽水消毒，馴化2 周后，挑取540 尾初始體質(zhì)量為（6.66±0.03）g 規(guī)格相近的鏡鯉幼魚，隨機分為6 組，每組3 個平行，每個平行30 尾魚，養(yǎng)殖8 周。試驗期間光照均勻，每天換水20%并定期清洗魚缸，保持水質(zhì)良好，使用經(jīng)曝氣處理的自來水配制不同堿度的試驗用水，水溫（23±0.5）℃，溶氧大于5.0mg/L，氨氮小于1.0 mg/L。試驗期間，每天7:30、12:30 和16:30 投喂3 次。

1.2.2 腸道形態(tài)指標的測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，每缸隨機取出3 尾魚，用100mg/L MS-222 麻醉后，置于冰盤上解剖，取出內(nèi)臟并分離腸道，剔除腸道表面附著的脂肪及肝臟組織，用預冷的0.86%生理鹽水清洗腸道后用濾紙吸干，截為前腸、中腸、后腸三段（前腸為腸道第一個回折之前的部分，中腸為第一個回折到最末一個回折的部分，后腸為最末回折處至肛門的部分）。取長度為1cm 左右的腸段固定于Bouin 氏液中，切片。采用Motic 顯微圖像系統(tǒng)（Motic Images Plus 2.0 軟件）測量每個切片中6 個以上完整腸道皺襞高度、絨毛寬度及腸道基膜厚度（μm，成像倍數(shù)為10×100），取其平均值。

1.2.3 腸道消化酶活性的測定

實驗結(jié)束時按照上述方法截取腸段，準確稱取腸道組織重量，按質(zhì)量體積比1∶9 與預冷的0.86%生理鹽水稀釋，采用FJ-200CL 高速勻漿機冰浴勻漿，按照試劑盒要求的離心速度和時間進行離心，離心后取組織上清液，分裝后于冰箱（-20℃）中保存，用于測定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。蛋白酶活性采用福林-酚（Folin-phenol）法測定；脂肪酶及淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，SPSS19.0 軟件分析。以不同堿度水平和AKG 濃度為影響因素，采用雙因素方差分析進行統(tǒng)計，用Duncan's 檢驗數(shù)據(jù)的顯著性，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同堿度和AKG 水平對鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表2 可知，堿度脅迫下，鏡鯉中腸的絨毛長度均低于淡水組（P＜0.05），隨著堿度上調(diào)，中腸絨毛長度變短；后腸的絨毛長度同中腸絨毛長度呈相同的變化趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。堿度脅迫使中腸絨毛寬度顯著降低（P＜0.05）；堿度和AKG 水平對前腸、后腸絨毛寬度無顯著影響（P＞0.05）。堿度和AKG 水平對前、中、后腸的基層厚度無顯著影響（P＞0.05）。雙因素方差分析顯示，堿度和AKG 對腸道形態(tài)的影響均沒有交互作用。

2.2 不同堿度和AKG 水平對鏡鯉腸道消化酶的影響

由表3 可知，堿度脅迫使鏡鯉前腸淀粉酶活性顯著降低（P＜0.05）；淡水組中，添加AKG 也顯著降低了前腸淀粉酶活性（P＜0.05）；而在15mmol/L 堿度水平下，飼喂添加1%AKG 飼料時，鏡鯉的前腸淀粉酶活性顯著提高（P＜0.05）；堿度和AKG 水平對前腸淀粉酶活性有交互作用（P＜0.05）。堿度脅迫下，前腸、中腸的蛋白酶活性顯著降低（P＜0.05）；低堿度條件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸鹽堿度），添加AKG提高了前腸和中腸蛋白酶的活性，但差異沒有達到顯著水平（P＞0.05）；堿度和AKG 水平對中腸蛋白酶活性有交互作用（P＜0.05）。隨著堿度水平提高，前腸、中腸脂肪酶活性顯著降低（P＜0.05）；淡水組中，添加AKG 顯著降低了中腸脂肪酶活性（P＜0.05），但堿度和AKG 水平對腸道脂肪酶活性無交互作用（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同堿度和AKG 水平對鏡鯉腸道組織形態(tài)的影響

松浦鏡鯉為無胃魚類，其腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收更為重要。魚類腸道的許多皺襞是增加腸道表面積的關(guān)鍵因素；絨毛長度和寬度以及基層厚度等指標可直接反應(yīng)皺襞形態(tài)，是反映水生動物腸道形態(tài)和吸收能力的重要標志[13]。水環(huán)境中的脅迫因子顯著影響魚類的生長發(fā)育，氨氮和亞硝酸鹽脅迫的研究已較為深入[14,15]。水體中氨氮含量升高可導致鯉腸絨毛上皮充血、融合及固有層細胞壞死等病癥[16]；pH 和堿度的升高也會導致鯉毒性，甚至死亡[17,18]。本試驗中，堿度升高降低了中腸的絨毛長度，且堿度越大，中腸絨毛長度越短；后腸的絨毛長度同中腸絨毛長度呈現(xiàn)相同的趨勢，但差異不顯著，且堿度脅迫還使中腸絨毛寬度增加，其原因有待進一步研究。AKG 為谷氨酰胺的前體物質(zhì)，外源添加可以代替部分谷氨酸和谷氨酰胺；AKG 在溶液中具有良好的穩(wěn)定性，能克服谷氨酰胺易降解的缺點[19]，提高腸道對其的吸收能力。已有研究表明，AKG 的添加對鏡鯉腸道形態(tài)具有積極作用[11]。本試驗中，與對照組（0mmol/L 堿度，0%AKG）組相比，淡水組添加1%AKG 的鏡鯉中腸絨毛長度顯著增加，這可能是因為AKG 可以為腸道上皮細胞提供能量[8]，促進上皮細胞增值[20]，促進腸道細胞的生長發(fā)育。堿脅迫下，飼喂添加AKG 飼料的鏡鯉前腸絨毛長度均高于對照組，而中腸絨毛長度中并沒有相似的效應(yīng)。雙重比較也表明，堿度和AKG 水平對腸道組織形態(tài)無交互作用。

3.2 不同堿度和AKG 水平對鏡鯉腸道消化酶的影響

腸消化酶活性決定鯉對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，影響鯉的生長發(fā)育。pH 對魚類消化酶活力具有一定的影響，一般隨pH 的升高消化酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[21,22]。水體堿度和pH 對魚類損傷具有協(xié)同作用[12,23]。本試驗中，堿度環(huán)境顯著抑制了鏡鯉的消化酶活性，這種變化也與堿度環(huán)境的脅迫有關(guān)。王萍等[3]分析堿脅迫下青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 腸道排泄物，發(fā)現(xiàn)堿脅迫使裸鯉腸道大量排出HCO3-離子。這些離子的存在可直接提高腸道內(nèi)pH，一般pH 過低或過高都會直接改變酶的構(gòu)象，影響酶與底物的結(jié)合和酶活性[24]。位瑩瑩[25]研究發(fā)現(xiàn)：飼料中添加AKG 顯著影響松浦鏡鯉腸道消化酶（如蛋白酶）活性，促進了腸道蛋白吸收；陳迪[10]等研究表明，添加AKG 可顯著提高鱘腸道蛋白酶活性。本試驗中，低堿度條件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸鹽堿度），日糧中添加1%AKG 提高了前腸和中腸蛋白酶活性，但效果不顯著；15 mmol/L 堿度水平下，飼喂添加AKG 飼料使實驗魚的前腸淀粉酶活性顯著上升；堿度和AKG 水平對前腸淀粉酶以及中腸蛋白酶活性均有交互作用；添加AKG 也有降低試驗魚前腸、中腸脂肪酶活性的作用，但堿度和AKG 水平對腸道脂肪酶活性均無交互作用。此結(jié)果與魏玉強[26]研究結(jié)果中，添加1.5%AKG 可顯著提高鏡鯉前腸和中腸蛋白酶和脂肪酶活性的部分結(jié)果相同，不完全相同的原因可能與鏡鯉的生長發(fā)育階段有關(guān)。

綜上所述，水體堿度脅迫可影響松浦鏡鯉中腸絨毛的發(fā)育并降低消化酶活性，且隨著堿度上調(diào)，中腸絨毛長度及前腸、中腸脂肪酶活性顯著下降。飼料中添加AKG 可顯著提高腸道淀粉酶及蛋白酶活性，對改善堿度脅迫下松浦鏡鯉消化功能具有一定的作用。