張偉健，劉宏，蘇薇薇，曾璇，王永剛，李沛波，彭維，姚宏亮

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州510275)

氣虛血瘀證是中醫(yī)臨床常見癥候之一，其既有氣虛之象，同時又兼有血瘀，可見于心腦血管疾病的不同發(fā)展階段。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣是人體賴以進(jìn)行生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)，氣為血之帥，氣能行血，氣虛則不能充分推動血液運(yùn)行，以致血行不暢而瘀滯；血為氣之母，血能生氣，血瘀則臟腑失養(yǎng)、生氣乏源，亦能致使氣虛[1]。氣虛與血瘀，往往同時并存，二者密不可分，相互影響。生活方式的改變致使氣虛血瘀已成為大多數(shù)現(xiàn)代人的體質(zhì)特征[2]。氣虛血瘀證作為現(xiàn)代人群的一個突出的體質(zhì)病理學(xué)特征，是許多疾病共有的病機(jī)特點(diǎn)。在臨床上，氣虛血瘀證常見于老年人的心腦血管疾病，如冠心病、腦卒中。王階等[3]對324個患有冠心病的病人進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)氣虛和血瘀是冠心病的最主要癥候要素。

力竭游泳法是制作氣虛血瘀證動物模型最為基礎(chǔ)的研究方法，絕大多數(shù)的多因素造模方法均建立在力竭游泳法之上。在氣虛血瘀證動物模型的建立上，前人已經(jīng)取得了可喜的成績，如單純力竭游泳誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型[4]、綜合饑餓、力竭游泳、寒涼等因素誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型[5]、力竭游泳復(fù)合藥物誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型[6]、力竭游泳復(fù)合手術(shù)誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型[7]等。血脂代謝異常是心腦血管疾病發(fā)生的重要因素之一。臨床上，肥胖人群患?xì)馓撗鲂偷男哪X血管疾病趨勢越發(fā)增高，然而，尚未見合適的動物模型以供相關(guān)中醫(yī)藥進(jìn)行防治研究。為此，本研究在力竭游泳的基礎(chǔ)上復(fù)合高脂飼喂，以建立新的氣虛血瘀證動物模型，以期為中醫(yī)藥防治氣虛血瘀型心腦血管疾病作用機(jī)理等基礎(chǔ)研究提供較為理想的實(shí)驗載體。

1 材 料

1.1 實(shí)驗動物

SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量220～260 g，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供。實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002。

1.2 實(shí)驗環(huán)境

實(shí)驗所用大鼠均飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，試驗期間，動物飼養(yǎng)所用的相應(yīng)飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物自由進(jìn)食飲水。

1.3 實(shí)驗儀器

BS-3000A電子分析天平(上海友聲衡器有限公司)；Morris水迷宮水池(水深40 cm，直徑160 cm，高50 cm，水溫19～21 ℃)；毛細(xì)管；秒表；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)；DS-261全自動生化分析儀(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司)；UNICO-UV2000分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；KDC-2046 低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.4 實(shí)驗藥品與試劑

戊巴比妥鈉(德國默克，批號：150828)，大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、乳酸(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、補(bǔ)體3(C3)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白M (IgM)、血小板活化因子(PAF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、前列環(huán)素(PGI-2)、血栓素(TXA2)等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 方 法

2.1 動物分組及造模方法

大鼠隨機(jī)分成空白對照組和模型組，每組10只動物?？瞻讓φ战M大鼠給予普通飼料進(jìn)行正常喂養(yǎng)，模型組大鼠給以高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)8周，從第9周開始，每天進(jìn)行一次力竭游泳，持續(xù)16 d，期間繼續(xù)保持高脂飼喂。游泳水溫控制在19～21 ℃，每次游泳至大鼠動作失調(diào)、水淹沒鼻尖，出現(xiàn)自然沉降10 s，即撈出，且游泳后不予擦拭水跡和保溫措施。

2.2 氣虛血瘀表征觀察

造模期間，觀察記錄大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、糞便、舌象、眼球、尾部等一般狀況。判斷大鼠是否出現(xiàn)氣虛血瘀癥狀[1]，如氣虛癥狀：精神萎靡，倦怠嗜睡，四肢蜷縮，活動性差，攻擊性、對抗性行為減少或消失；食欲不振，糞便烯溏；毛發(fā)稀疏，脫落，干燥無彩。血瘀癥狀：舌質(zhì)較空白對照組明顯絳紫暗；尾部自尖至根出現(xiàn)不同程度青斑或皮下瘀紫；眼球較空白對照組更鮮紅或轉(zhuǎn)為暗紅。

2.3 血液指標(biāo)檢測

造模結(jié)束后，2組大鼠均禁食不禁水12 h，使用w=3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，一部分血樣用于測定毛細(xì)管凝血時間，另一部分血樣室溫靜置約30 min，然后進(jìn)行10 min轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心，取血清，采用全自動生化分析儀檢測肝腎功能指標(biāo)ALT、AST、Cr、BUN、UA；血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C、HDL-C；能量代謝及心肌酶指標(biāo)LD、LDH、CK-MB。采用比色法檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA。采用酶聯(lián)免疫方法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α；免疫應(yīng)答指標(biāo)C3、IgA、IgG、IgM；血管內(nèi)皮功能指標(biāo)ET-1、PGI-2、TXA2；血小板活化因子PAF。以上操作均嚴(yán)格按照各類試劑盒(南京建成生物工程研究所)使用說明書進(jìn)行。上述生化指標(biāo)的檢測均于2017年5月在南京建成生物工程研究所完成。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”呈現(xiàn)，組間差異統(tǒng)計采用t檢驗，SPSS 19.0軟件實(shí)現(xiàn)，P值小于0.05或0.01認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠表征觀察

與正常大鼠相比，模型大鼠出現(xiàn)了氣虛血瘀癥狀，如精神萎靡，倦怠嗜睡，四肢蜷縮，活動性差，攻擊性、對抗性行為減少或消失，后肢行動遲緩艱難(見圖1)，舌質(zhì)較對照組明顯絳紫暗(見圖2)。

圖1 單次力竭游泳的大鼠

圖2 模型大鼠氣虛血瘀表征

3.2 生化指標(biāo)檢測

如表1所示，與空白對照組相比，模型組大鼠所檢測26個指標(biāo)均發(fā)生顯著性變化(P<0.05或P<0.01)，提示模型大鼠機(jī)體出現(xiàn)能量代謝紊亂，心肌損傷，氧化應(yīng)激失衡，炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答功能失調(diào)，肝腎功能障礙，脂質(zhì)代謝異常，內(nèi)皮功能紊亂，凝血功能異常等氣虛血瘀相關(guān)病變。

4 討 論

目前，氣虛血瘀證動物模型的制作方法多種多樣，主要可分為單因素造模方法和多因素結(jié)合造模方法。多因素結(jié)合造模方法又可分為病因造模、結(jié)合現(xiàn)代藥理因素造模以及病癥結(jié)合這三種類型。力竭游泳法是制作氣虛血瘀證動物模型最為基礎(chǔ)的研究方法，眾多學(xué)者也采用力竭游泳結(jié)合其他造模因素進(jìn)行氣虛血瘀大鼠模型的制作，見表2。

有研究表明動物力竭游泳兩周即可出現(xiàn)氣虛血瘀狀態(tài)[4]，在參考前人研究的基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)“肥甘厚味傷脾損氣”“勞則氣耗”等中醫(yī)理論，對動物進(jìn)行長期慢性高脂飲食，礙胃而傷脾，既可減少其生氣之源，又可助生痰濕導(dǎo)致瘀血證的發(fā)生[8]；力竭游泳以增加其正氣消耗，“氣為血之帥”，氣虛則無力推動血液運(yùn)行，經(jīng)脈之血則停滯淤積形成瘀血[9]。本模型保證了氣虛為始動因素，并作為主要因素貫徹了整個造模過程。本模型更加貼近臨床，且模型動物氣虛血瘀癥候持續(xù)時間長，動物不易恢復(fù)。

表1 大鼠生化指標(biāo)檢測情況1)

Table 1 Biochemical index detection of the rats

功能指標(biāo)組別空白對照模型能量代謝及心肌酶LD /(mmol·L-1)5.66±1.296.71±1.28?LDH/(U·L-1)4 429.10±765.325 080.36±598.29??CK-MB/(ng·mL-1)1.65 ±0.392.02 ±0.53?氧化應(yīng)激SOD/(U·mL-1)298.69 ±14.30273.86 ±28.79??MDA/(nmol·mL-1)7.71±0.719.67±2.50?炎癥因子IL-1β/(ng·L-1)13.54±2.3615.57±2.27??TNF-α/(ng·L-1)187.74±18.20247.32±48.71??IL-6/(ng·L-1)29.93±1.6033.90±4.07??IL-8/(ng·L-1)7.87±2.339.85±2.64?免疫應(yīng)答IgA/(μg·mL-1)644.38±167.10788.50±152.64??IgM/(μg·mL-1)178.31±33.13210.37±41.25??IgG/(mg·mL-1)7.10±1.278.67±2.40?C3/(mg·mL-1)1.53±0.271.75±0.304肝腎功能ALT/(U·L-1)32.67±3.7689.53±18.92??AST/(U·L-1)117.69±30.67232.15±34.95??Cr/(μmol·L-1)30.57±6.8039.47±13.88?BUN/(mmol·L-1)4.21±0.996.74±1.80??脂質(zhì)代謝TG/(mmol·L-1)3.47±0.984.03±0.80?TC/(mmol·L-1)2.98±0.843.81±0.73??HDL-C/ (mmol·L-1·L-1)0.94±0.210.56±0.16??LDL-C/(mmol·L-1)0.53±0.200.91±0.25??內(nèi)皮功能ET-1/(ng·L-1)53.48±8.2086.70±13.71??PGI2/(ng·L-1)144.96±29.58119.92±29.44?TXA2/(pg·mL-1)160.72±11.93181.54±22.74??凝血功能PAF/(ng·mL-1)2.61±0.542.94±0.47?CT/s293.70±60.75144.53±71.53??

1)與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，每組10只動物

表2 氣虛血瘀證動物模型制備方法比較一覽表

Table 2 Summary of qi deficiency and blood stasis animal model

類別具體方法檢測指標(biāo)特點(diǎn)單純力竭運(yùn)動力竭游泳法[4]表征觀察、血液流變能夠模擬“氣虛”導(dǎo)致“血瘀”的過程結(jié)合病因造模綜合饑餓、力竭游泳、寒涼等因素[5]表征觀察、免疫功能、血液流變、自由基能夠模擬出氣虛血瘀癥候結(jié)合現(xiàn)代藥理因素造模力竭游泳復(fù)合藥物注射[6]血液流變能夠模擬出氣虛血瘀癥候病癥結(jié)合造模力竭游泳復(fù)合相關(guān)醫(yī)學(xué)疾病的具體手術(shù)[7]體征觀察、內(nèi)皮功能、血液流變、腦水腫貼近臨床

關(guān)于氣虛血瘀證的評價體系，目前尚不完善。在以往的研究中，前人普遍從動物的整體表征及血液流變學(xué)的改變以判斷氣虛血瘀證模型的成立與否。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始嘗試研究相關(guān)的微觀指標(biāo)以科學(xué)客觀地評價該證候，有研究報道分別從血管調(diào)控物質(zhì)、能量代謝、血液流變學(xué)改變等多個微觀角度初步揭示了氣虛血瘀證的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，并指出脂質(zhì)過氧化損傷與血管調(diào)控失常是導(dǎo)致氣虛血瘀模型大鼠器官損傷的重要病理機(jī)制[10-11]。此后，在該證候動物模型的研究中不乏相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)檢測。

在本研究中，模型成立的評價標(biāo)準(zhǔn)除了動物宏觀特征的觀察外，還分別選取了能量代謝、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、免疫炎癥、內(nèi)皮功能以及凝血時間等多個微觀指標(biāo)進(jìn)行評價。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠在高脂飼喂結(jié)合力竭游泳后，表現(xiàn)出中醫(yī)臨床上氣虛血瘀的敏感表征，如氣虛的敏感表征：倦怠嗜睡，精神委頓，四肢蜷縮，活動性差等，以及血瘀的敏感表征：舌質(zhì)較空白對照組明顯絳紫暗等。以上表征的確立，證明了以高脂飼喂結(jié)合力竭游泳可以制備大鼠氣虛血瘀狀態(tài)。此外，微觀生化指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示模型大鼠出現(xiàn)了氣虛血瘀的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的病變。

乳酸是糖酵解的終產(chǎn)物。乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，能催化乳酸與丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)化。本研究中，模型組大鼠的乳酸含量與乳酸脫氫酶活力均顯著升高，提示造模后，模型大鼠能量代謝不足，糖代謝多只進(jìn)行到無氧酵解階段，機(jī)體產(chǎn)生大量乳酸，使得機(jī)體處于倦怠狀態(tài)，能量代謝的不足是氣虛的典型表現(xiàn)。SOD是清除自由基的首要物質(zhì)，人體內(nèi)最主要的抗氧化酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)虛證的發(fā)生與SOD的活性下降關(guān)系密切[12]。MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)形成的氧化終產(chǎn)物，可體現(xiàn)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，并可間接表征細(xì)胞的損傷程度。模型大鼠SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高，表明機(jī)體處于自由基代謝失衡狀態(tài)，機(jī)體自由基清除能力下降，自由基的增多加重機(jī)體的過氧化損傷，機(jī)體虛損程度較重。

血管活性物質(zhì)失衡是臨床氣虛血瘀證重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。ET-1是目前內(nèi)源性作用最強(qiáng)的血管收縮肽[13]。TXA2促進(jìn)血小板聚集，而PGI2擴(kuò)張血管和抗血小板聚集。TXA2和PGI2平衡失調(diào)，會導(dǎo)致血栓形成[14]。模型組大鼠ET-1含量顯著升高，PGI2含量顯著降低，TXA2含量顯著升高，表明模型大鼠血管內(nèi)皮受到損傷，血管舒縮功能出現(xiàn)障礙，容易出現(xiàn)血栓。PAF是迄今發(fā)現(xiàn)的最具強(qiáng)烈活性的脂類介質(zhì)，具有強(qiáng)烈的促血小板聚集和釋放作用[15]。PAF含量顯著升高，毛細(xì)管凝血時間顯著縮短，表明模型大鼠血小板聚集增強(qiáng)，血液處于高凝高黏的狀態(tài)，大鼠出現(xiàn)血瘀癥狀，符合氣虛血瘀證的特點(diǎn)。

此外，模型大鼠還出現(xiàn)了免疫應(yīng)答失調(diào)，有明顯的炎性反應(yīng)，且心肌出現(xiàn)損傷，肝腎功能出現(xiàn)障礙，由此得出模型大鼠組織器官損害較為顯著，多個組織器官出現(xiàn)一定程度的損害提示在高脂飲食、勞倦等因素作用下，臟腑功能逐漸虛衰可致氣虛血瘀，多器官的生理功能的減退，也在一定程度上體現(xiàn)出了模型大鼠全身性的氣虛血瘀病變。

綜上所述，本模型創(chuàng)新性地結(jié)合高脂飼養(yǎng)、力竭游泳這兩種因素誘導(dǎo)氣虛血瘀，這樣的氣虛血瘀證模型死亡率低，成功率高，且操作簡單易行。該模型在能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、內(nèi)皮功能、脂質(zhì)代謝、肝腎功能以及血流變等各個方面均發(fā)生顯著變化，可應(yīng)用于藥物治療氣虛血瘀型心腦血管疾病療效的考察，對中藥多靶點(diǎn)綜合作用的評價具有較高應(yīng)用價值。