劉小鳳，劉蔚，聶宇，叢佩清，劉小紅，陳瑤生，何祖勇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/Cas9技術(shù)是近年來新發(fā)展的三種基因組編輯技術(shù)，它們均是通過引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶切割DNA靶位點(diǎn)序列，形成DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。細(xì)胞一般通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homology-directed repair，HDR)兩種不同的DNA修復(fù)途徑來實(shí)現(xiàn)基因組編輯，包括基因敲除(knockout)、基因定點(diǎn)突變及外源基因的定點(diǎn)整合(knockin)等。

ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和IIS型限制性內(nèi)切酶FokⅠ融合構(gòu)成。3～5個串聯(lián)的ZFP構(gòu)成ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與DNA靶位點(diǎn)特異性結(jié)合，然后引導(dǎo)FokⅠ蛋白二聚體發(fā)揮DNA切割功能[1- 2]。TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)類似，是通過類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子(TALE)與DNA靶位點(diǎn)特異結(jié)合，誘導(dǎo)FokⅠ蛋白二聚體在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割[3]。而CRISPR/Cas9技術(shù)則是通過人工合成的單鏈引導(dǎo)RNA(single strand guide RNA, sgRNA)序列與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行DNA雙鏈切割[4]。近年來，這三種基因組編輯技術(shù)以高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)在基因敲除方面得到了廣泛應(yīng)用，但是對于定點(diǎn)整合外源基因，三者達(dá)到的效率參差不齊，且目前尚未見在同一位點(diǎn)上對這三種基因組編輯技術(shù)介導(dǎo)的外源DNA片段整合效率進(jìn)行系統(tǒng)比較的研究報(bào)道。因此本研究設(shè)計(jì)了靶向小鼠Rosa26基因同一個位點(diǎn)的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，首先在C2C12細(xì)胞中比較了三者的靶向切割效率，然后構(gòu)建了一個含有黑色素生成相關(guān)的酪氨酸酶基因Tyr和紅色熒光蛋白報(bào)告基因DsRed的無啟動子同源重組質(zhì)粒供體pTyr-2A-DsRed，在基因編輯工具的介導(dǎo)下，只有正確整合到小鼠Rosa26基因的供體載體才能啟動Tyr及DsRed基因的表達(dá)，通過對比轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度，本研究系統(tǒng)比較了三種基因組編輯工具介導(dǎo)外源DNA定點(diǎn)整合的效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的效率最高，在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9將供體整合到小鼠胚胎干細(xì)胞中，篩選單細(xì)胞克隆進(jìn)行囊胚腔注射和胚胎移植，獲得一只存活的嵌合體小鼠，表現(xiàn)出白毛中夾雜黑毛的表型，這表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

C2C12細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠胚胎干細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，昆明小鼠(Kunming mice, KM)來自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，pX458質(zhì)粒(Cas9/sgRNA共表達(dá)質(zhì)粒)購自Addgene公司。PCR引物及載體構(gòu)建相關(guān)的oligo序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1Rosa26基因靶位點(diǎn)選擇 應(yīng)用ZiFiT在線分析軟件(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)對小鼠Rosa26基因內(nèi)含子1的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)1對ZFN和2對TALEN；應(yīng)用CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)一條gRNA，使三者的切割位點(diǎn)幾乎重疊(圖1:A)。

1.2.2 ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

1) ZFN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

ZFN與Rosa26內(nèi)含子的結(jié)合區(qū)域如圖1:A所示，兩段ZFN結(jié)合序列中間的序列為切割位點(diǎn)。ZFN質(zhì)粒由SIGMA公司合成。

2) TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

TALEN與Rosa26內(nèi)含子的結(jié)合區(qū)域如圖1:A所示，TALEN質(zhì)粒采用本實(shí)驗(yàn)室前期使用的“Golden Gate”方法構(gòu)建[5]。

3) CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

pX458載體可同時表達(dá)sgRNA、Cas9蛋白以及EGFP熒光蛋白，通過BbsⅠ酶切可將gRNA序列連進(jìn)載體。合成gRNA正負(fù)單鏈時，在5′端加上與BbsⅠ內(nèi)切酶開pX458載體后的粘性末端互補(bǔ)的序列(表1)，將合成好的gRNA正負(fù)單鏈粉末稀釋至100 μmol/L，進(jìn)行g(shù)RNA的磷酸化和退火，使之形成具有粘性末端的雙鏈DNA短片段。將退火并磷酸化的gRNA雙鏈短片段和pX458載體通過BbsⅠ內(nèi)切酶和T4連接酶進(jìn)行酶切和連接反應(yīng)，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，測序驗(yàn)證CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

圖1 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 靶向切割效率鑒定

表1 靶向小鼠Rosa26基因的gRNA oligo序列

1.2.3 同源重組質(zhì)粒供體構(gòu)建 在小鼠中，黑色素沉積的類型與數(shù)量差異造成了不同的毛色表型。動物的黑色素分為兩類：真黑色素(eumelanin)與褐黑色素(pheomelanin)，這兩種黑色素的合成均依賴于酪氨酸的氧化，而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化的關(guān)鍵酶[6]。當(dāng)外源Tyr基因整合進(jìn)白毛色小鼠中，成功整合外源Tyr基因的白色小鼠會產(chǎn)生黑色素沉積，產(chǎn)生不同于對照組的毛色表型[7]。因此當(dāng)構(gòu)建基因敲入小鼠時，Tyr可以作為一個遺傳篩選標(biāo)記，使我們可以通過毛色來快速、高效地鑒別Knockin小鼠。Parikh團(tuán)隊(duì)在2015年用CRISPR/Cas9技術(shù)插入了Tyr基因，并成功得到了毛色改變的嵌合體小鼠[8]。

為方便、快捷地獲得Tyr基因整合的小鼠，我們構(gòu)建了pTyr-2A-DsRed同源重組質(zhì)粒供體(圖2: A)，供體包含位于兩側(cè)的同源臂和位于中間的外源插入序列。研究表明，同源臂長度為1 kb左右時具有最優(yōu)的同源重組效率[9]。我們所設(shè)計(jì)的5′同源臂序列長度為921 bp，3′同源臂序列長度873 bp。插入序列包括了需整合的Tyr基因序列與紅色熒光報(bào)告基因(DsRed)序列，此外，還有一個剪接受體位點(diǎn)(splicing acceptor, SA)，該受體位點(diǎn)的存在使插入序列被整合到基因組后，在轉(zhuǎn)錄后剪接時可與5′端外顯子連接，保證插入序列可以正常翻譯[10-11]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選用15代以內(nèi)的細(xì)胞，胰酶消化后，1 600 r/min離心4 min，吸掉上清，加入1 mL PBS洗滌并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。計(jì)數(shù)后，將PBS細(xì)胞懸液1 600 r/min離心4 min，吸掉上清，按每1×106細(xì)胞加入100 μL細(xì)胞懸浮液R，吹打均勻。同時按照每100 μL細(xì)胞懸浮液加入5 μg質(zhì)粒，輕輕吹打均勻備用，電轉(zhuǎn)染參數(shù)設(shè)置為1 400 V，20 ms，2 pulse。將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞接種至預(yù)熱好的培養(yǎng)皿內(nèi)，48 h后可在顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，分析轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 T7EⅠ實(shí)驗(yàn) T7EⅠ酶 (T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ)可以用來檢測基因編輯工具介導(dǎo)的基因突變效率。其檢測原理為：先擴(kuò)增出包含打靶位點(diǎn)的基因序列，T7EⅠ酶可以識別擴(kuò)增產(chǎn)物中包含的雜交異源雙鏈DNA，并在識別位點(diǎn)進(jìn)行切割，使酶切產(chǎn)物中包含擴(kuò)增主帶以及酶切后斷裂而成的兩條較小的DNA條帶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出3條大小不一的條帶，從而估算出CRISPR/Cas9的打靶效率。

首先設(shè)計(jì)T7EⅠ引物，使PCR擴(kuò)增打靶位點(diǎn)共約500 bp的序列長度，使位點(diǎn)位于序列約100～200 bp的位置(表2)。收集細(xì)胞并提取基因組，PCR擴(kuò)增出包含3種基因工具識別位點(diǎn)的Rosa26基因片段，后用膠回試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物高溫變性后，經(jīng)逐步降溫退火形成異源雙鏈DNA，在變性退火產(chǎn)物中加入0.5 μL T7EⅠ酶，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)30 min。配制w=10%的PAGE膠用于酶切電泳，電泳參數(shù)設(shè)置為電壓120 V，時間90 min。電泳結(jié)束后，小心取出PAGE膠，于配制好的核酸染料中染色15 min左右。染色后用清水清洗3次去除殘余的核酸染料，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。通過Image J軟件估算3種基因編輯工具的切割效率。

表2 Rosa26編輯位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物

1.2.6 流式分選 電轉(zhuǎn)后48 h細(xì)胞熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，可進(jìn)行流式分選。用胰酶消化貼壁細(xì)胞，1 600 r/min離心4 min，吸掉上清，用PBS重懸。將細(xì)胞懸液經(jīng)50 μm尼龍膜過濾到流式管中，以防堵塞流式分選儀，同時準(zhǔn)備接收陽性細(xì)胞的培養(yǎng)皿，在FACScalibur流式細(xì)胞分析儀上可分析細(xì)胞的熒光比例與強(qiáng)度。對于要分選培養(yǎng)單克隆的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀設(shè)置為96孔板，每孔1個細(xì)胞，用添加了含有w=20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板收集，培養(yǎng)7 d后換液并進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.7 嵌合體小鼠制備 促排四周齡母小鼠，并與公鼠合籠，檢查交配栓。3.5 d后用引頸法處死母鼠，并收集輸卵管和子宮中的胚胎，轉(zhuǎn)移到覆有石蠟油的M16培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。

將分選并擴(kuò)培后的ES單克隆細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基液滴內(nèi)，同時將培養(yǎng)好的囊胚轉(zhuǎn)移到液滴內(nèi)。用顯微注射系統(tǒng)將ES細(xì)胞注射到囊胚腔內(nèi)，每個囊胚注射10～12個ES細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)1～3 h，待囊胚腔恢復(fù)后，移入代孕母鼠子宮中。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9靶向切割效率鑒定

將構(gòu)建好的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組，通過PCR擴(kuò)增Rosa26靶位點(diǎn)序列，通過T7EⅠ酶切法分析3種基因編輯工具的靶向切割活性，酶切結(jié)果顯示ZFN和TALEN-A無明顯的靶向切割活性，TALEN-B和CRISPR/Cas9有明顯的切割活性，其中CRISPR/Cas9的切割活性略強(qiáng)(圖1: B)。進(jìn)一步的TA克隆測序分析結(jié)果驗(yàn)證了T7EⅠ酶切結(jié)果，其中ZFN在靶位點(diǎn)引起Indel的效率為4.1%(2/49)，TALEN-A為4.2%(2/48)，TALEN-B為24%(12/50)，而CRISPR/Cas9為30%(12/40)(圖1: C)。因此，CRISPR/Cas9在該位點(diǎn)具有相對較高的靶向切割活性。

2.2 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9定點(diǎn)整合外源基因的效率比較

將ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒分別與同源重組質(zhì)粒供體共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞中，24 h后通過熒光顯微鏡可觀察到少數(shù)表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed的細(xì)胞(圖2:B)，表明部分供體質(zhì)粒在基因編輯工具的介導(dǎo)下通過同源重組正確整合到Rosa26位點(diǎn)。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀對DsRed陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示在C2C12細(xì)胞中，ZFN的Knockin效率為(0.11 ± 0.05)%，TALEN-A和TALEN-B的效率分別為(0.13 ± 0.06) %和(0.08 ± 0.02) %，CRISPR/Cas9的效率為(1.36 ± 0.40)%(圖2:C)，表明CRISPR/Cas9介導(dǎo)的定點(diǎn)整合效率明顯高于ZFN和TALEN。

2.3 利用CRISPR/ Cas9構(gòu)建定點(diǎn)整合外源基因的ES細(xì)胞株

由于CRISPR/Cas9具有較強(qiáng)的基因定點(diǎn)整合效率，因此本研究選用CRISPR/Cas9作為基因編輯工具來構(gòu)建Tyr定點(diǎn)整合的ES細(xì)胞。將構(gòu)建好的pX458-Rosa26質(zhì)粒與質(zhì)粒供體共轉(zhuǎn)染至ES細(xì)胞中，流式分選出表達(dá)有GFP的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，熒光顯微鏡下可見在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，ES細(xì)胞開始形成島狀的細(xì)胞克隆，部分ES細(xì)胞克隆同時表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白和DsRed紅色熒光蛋白(圖3: A)。應(yīng)用克隆環(huán)消化帶有熒光標(biāo)記的ES細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，待其數(shù)量足夠時，取一部分細(xì)胞提取基因組并進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。在得到的5個單細(xì)胞克隆中，有3個克隆成功擴(kuò)增出了中間的Tyr基因插入序列，其中#3、#4克隆同時成功擴(kuò)增出了右側(cè)邊界片段(圖2:A, 圖3:B和圖3: C)。其中#3 ES克隆右側(cè)邊界片段序列圖譜表明外源供體質(zhì)粒3′端完整地整合到了打靶位點(diǎn)，質(zhì)粒與打靶位點(diǎn)交界處沒有發(fā)生堿基的缺失或插入等(圖3:D)。

圖2 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 定點(diǎn)整合外源基因的效率鑒定

2.4 構(gòu)建外源基因整合的嵌合體小鼠

挑選正確整合了Tyr-2A-DsRed基因的3# ES單克隆細(xì)胞注射入昆明白小鼠的囊胚腔中，并將囊胚移植到代孕昆明白母鼠輸卵管內(nèi)，最終母鼠成功誕下一只健康存活的嵌合體小鼠，毛色與普通昆明白小鼠明顯不同：白毛夾雜著黑毛(圖4: A)。近距離觀察眼球，其虹膜顏色比對照小鼠明顯偏暗(圖4:B)，表明整合進(jìn)Rosa26基因的Tyr基因可以正確表達(dá)，促進(jìn)黑色素合成，使嵌合體小鼠表現(xiàn)出不同的毛色表型和虹膜顏色。

3 討 論

本研究設(shè)計(jì)了靶向小鼠在Rosa26內(nèi)含子的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因編輯工具，使三者在同一打靶位點(diǎn)對外源Tyr基因進(jìn)行定點(diǎn)整合。在驗(yàn)證三種基因編輯工具的靶向切割活性時發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的ZFN切割活性最低，僅為4.1%；兩對TALEN中有一對的切割活性可達(dá)到24%；而CRISPR/Cas9的切割活性最強(qiáng)，可達(dá)到30%。因此，針對本研究中既定打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)基因編輯工具，要獲得高活性的ZFN難度較大，TALEN居中，CRISPR/Cas9較小。

研究表明，由ZFN或CRISPR/Cas9通過HDR介導(dǎo)的DNA片段的定點(diǎn)整合通常效率較低，尤其在哺乳動物細(xì)胞中，通過同源重組實(shí)現(xiàn)DNA片段定點(diǎn)整合效率約為10-6～10-5[12-13]?；蚓庉嫻ぞ叩倪x擇在一定程度上可以影響定點(diǎn)整合的效率，在同源序列存在的情況下，由基因編輯工具所造成的DNA發(fā)生雙鏈斷裂能促進(jìn)同源重組修復(fù)，從而提高定點(diǎn)整合外源基因的效率[14]。本研究對紅色熒光的分析結(jié)果顯示，在C2C12細(xì)胞中，ZFN和TALEN的介導(dǎo)的定點(diǎn)整合效率約為0.1%～0.3%，CRISPR/Cas9的效率達(dá)到2.74%，具有明顯的優(yōu)勢，這與前期CRISPR/Cas9具有最佳的切割效率的結(jié)果是一致的。

圖3 利用CRISPR/ Cas9構(gòu)建外源基因定點(diǎn)整合ES細(xì)胞克隆

圖4 構(gòu)建Tyr基因定點(diǎn)整合的嵌合體小鼠

使用CRISPR/Cas9對無啟動子的質(zhì)粒供體pTyr-2A-DsRed進(jìn)行定點(diǎn)整合時，本研究利用pX458載體上攜帶的EGFP報(bào)告基因，通過流式分選可快速富集轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步通過流式分析定點(diǎn)整合到基因組上的供體上的紅色熒光蛋白DsRed，即可快速鑒定定點(diǎn)整合的效率。相對于傳統(tǒng)的正負(fù)藥物篩選定點(diǎn)整合的細(xì)胞單克隆，此方法省去繁瑣的篩選過程，更加省時高效。

對于定點(diǎn)整合的細(xì)胞基因組的巢式PCR擴(kuò)增得到了3′端邊界序列和中間插入序列的條帶，證明了外源基因的成功整合。而針對5′端邊界序列的擴(kuò)增無明顯目的條帶，我們推測可能是由非常規(guī)重組(illegitimate recombination)引起的。非常規(guī)重組與同源重組在哺乳動物細(xì)胞DSB修復(fù)過程中互為競爭關(guān)系，研究表明，非常規(guī)重組可能導(dǎo)致在基因組與donor連接位置處發(fā)生復(fù)雜的DNA重組，包括DNA缺失，重復(fù)，插入和倒位等[15-16]。當(dāng)然左側(cè)同源臂的大量GC重復(fù)序列也在一定程度上增加了擴(kuò)增的難度。

最后，我們成功得到了一只整合了Tyr基因的嵌合體小鼠，該小鼠相對于非嵌合體小鼠具有明顯的毛色區(qū)別。通過觀察毛色變化可以更加直觀、快速地鑒別目標(biāo)外源基因整合小鼠，這為今后制作Rosa26定點(diǎn)整合小鼠提供了一種簡便高效的方法。