郭佳，落繼先

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）是最早發(fā)現(xiàn)的一類多功能細胞因子，在胚胎發(fā)育、血管生成、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)與器官纖維化，以及細胞的增殖、分化和凋亡等生理病理過程中具有重要作用[1]。TGF-β分為很多種，其中最受關(guān)注的是TGF-β1。TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導通路的異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，例如口腔鱗癌、乳腺癌和膀胱癌等[2]。TGF-β1 通常以自分泌或旁分泌的方式作用于細胞，誘導細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesen?chymal transition，EMT）。TGF-β1 通路與 EMT 進程密不可分[3]，因此 TGF-β1 常常作為 EMT 發(fā)生的陽性對照物[4]。

EMT 是指上皮細胞失去特性獲得間質(zhì)細胞表型的一種現(xiàn)象。EMT 分為3 類：Ⅰ型EMT 與胚胎發(fā)育進程有關(guān)；Ⅱ型EMT 與創(chuàng)傷愈合、組織再生和器官纖維化的過程有關(guān)；Ⅲ型EMT 發(fā)生在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中[5]。Ⅰ、Ⅲ型EMT 較為相似，都是形成新的上皮細胞，而Ⅱ型EMT 則發(fā)生組織和器官纖維化。盡管EMT 類型各異，但都具有相同的生化背景，所以在生物學標志物和研究方法上有許多共通之處。

EMT 的標志性變化包括細胞形態(tài)學和基因的表達量[6]。細胞形態(tài)學的改變包括具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞[7]；在EMT 過程中，上皮細胞失去原有的細胞形態(tài)和特征，變成類似間質(zhì)細胞的紡錘形[8]。基因表達量的改變包括：①α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達量增加。α-SMA 是肌成纖維細胞的重要組成蛋白，能夠控制收縮肌細胞特異性運動，其含量間接反映肌成纖維細胞的增殖、活化狀態(tài)和纖維化程度[9]；②β連環(huán)素（βcatenin）逐漸由細胞質(zhì)更多地進入細胞核。βcatenin 具有雙重調(diào)節(jié)功能，并且能夠獨立發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，一是作為一種重要的細胞間黏附分子和細胞骨架成分，與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結(jié)合形成復(fù)合體均勻分布在細胞膜上，參與調(diào)節(jié)細胞黏附；二是參與Wnt 經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10]；③鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（SNAI1）表達量增加。SNAI1 具有促進腫瘤細胞EMT 和腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的作用，SNAI1 表達量升高會下調(diào)E-cadherin 的表達量，促進細胞轉(zhuǎn)移[11]；④E-cadherin 表達量減少。E-cad?herin 是上皮細胞間黏附分子，E-cadherin 表達量減少，會減弱上皮細胞間的相互作用[12]。

在本研究中，我們采用TGF-β1 刺激人肺支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cells，HBEC），觀察細胞形態(tài)和檢測EMT 標志基因mRNA 的表達量，研究 TGF-β1 對 HBEC 的影響。關(guān)于EMT 已有一些研究，加深對EMT 相關(guān)調(diào)控因子的探討，不僅有助于更好地理解EMT 的發(fā)生，而且為了解腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)機制提供了新思路，同時以EMT 為靶點的抗腫瘤新型藥物的研發(fā)也將是一個新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

HBEC 購于中國科學院細胞庫，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

DMEM 高糖培養(yǎng)基購于Gibco 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；TGF-β1 購自 PeproTech 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ購于TaKaRa 公司；TRIzol 購于 Invitrogen 公司；DAPI 和FITC-鬼筆環(huán)肽購于索萊寶公司。

1.2 形態(tài)學觀察

將HBEC 消化離心后制成細胞懸液，接種于6孔板中，加入DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至細胞貼壁均勻生長至70%左右，加入約2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基（無血清），過夜饑餓細胞16 h 后加入TGF-β1（10 ng/mL），每天固定時間換液（含 10 ng/mL TGF-β1 的完全培養(yǎng)基）。培養(yǎng)0、1、2、3、4和5 d 時觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.3 免疫熒光技術(shù)

實驗組用10 ng/mL TGF-β1 處理HBEC 4 d（對照組用PBS，其余條件完全一致），然后將2 組細胞鋪板，PBS 洗滌2 次；4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 洗滌 3 次，每次 10 min；用 1% Triton-100 室溫下透化 15 min；加入 200 μL FITC-鬼筆環(huán)肽（5 μg/mL），覆蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育 30 min，PBS 洗滌玻片 3 次，每次 5 min；用 200 μL DAPI 溶液（100 nmol/L）對細胞核染色5 min，PBS 洗滌蓋玻片，滴加封片劑封片；于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 實時熒光定量PCR實驗

從 NCBI 數(shù) 據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取人SNAI1、E-cadherin、α-SMA和β-catenin的基因轉(zhuǎn)錄本，利用Primer 5 設(shè)計特異性引物（引物序列見表1）。將引物進行PCR 驗證后用于實時熒光定量PCR 實驗。

用TRIzol 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用ABI7500 實時熒光定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR，檢測EMT 標志基因的mRNA 表達量。15 μL 反應(yīng)體系包括SYBR green Premix Ex TaqⅡ 7.5 μL，滅菌雙蒸水 3.45 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，上、下游引物各 0.375 μL（10 μmol/L），cDNA 3 μL。空白對照組模板為滅菌的雙蒸水。反應(yīng)程序為 50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，記錄擴增曲線、熔解曲線及樣本的循環(huán)閾值（Ct），以GAPDH為內(nèi)參基因，通過 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量[13]。每個樣品同時設(shè)3 個重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計學分析處理

運用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件對所獲數(shù)據(jù)進行分析，實驗結(jié)果用x±SD表示，采用 ANOVA 單因素方差分析檢驗實驗組和對照組間差異的顯著性，2組組間比較采用t檢驗，*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1可以誘導HBEC發(fā)生類似EMT的形態(tài)改變

HBEC 經(jīng) 10 ng/mL TGF-β1 處理 0、1、2、3、4和5 d 后，用相差光學顯微鏡觀察，結(jié)果見圖1。TGF-β1 刺激 2 d 時就可以誘使 HBEC 發(fā)生類似EMT 的形態(tài)改變，3、4 和 5 d 處理組尤為明顯。HBEC 空白對照組呈經(jīng)典的鵝卵石上皮細胞形態(tài)，但是經(jīng)過TGF-β1 處理后，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)榧忓N形，更多地呈現(xiàn)間質(zhì)纖維細胞形態(tài)（類似EMT 形變細胞已用紅色箭頭標出）。

表1 引物及序列

圖1 TGF-β1 誘導 HBEC 形態(tài)變化

2.2 TGF-β1引起細胞骨架發(fā)生改變

實驗組用10 ng/mL TGF-β1 處理HBEC 4 d（對照組用PBS，其余實驗條件完全一致），在顯微鏡下觀察HBEC 骨架，結(jié)果如圖2。與對照組相比，TGF-β1 處理HBEC 4 d 時細胞骨架發(fā)生明顯改變，逐漸變?yōu)榧忓N形（紅色箭頭）。

2.3 TGF-β1對HBEC中EMT標志基因mRNA表達量的影響

利用實時熒光定量PCR 檢測TGF-β1 處理細胞 0、1、3 和 6 h 的 mRNA 表達量。如圖3 所示，與對照組相比，SNAI1在 3 h、E-cadherin在 6 h 的mRNA 表達量顯著升高，α-SMA和β-catenin在各時間點mRNA 表達量都顯著下降。

圖2 TGF-β1 誘導細胞骨架變化

圖3 TGF-β1 處理 HBEC 0～6 h EMT 標志基因 mRNA 的表達量

利用實時熒光定量PCR 檢測TGF-β1 處理細胞 0、1、2、3、4 和 5 d 的 mRNA 表達量。如圖4 所示，與對照組相比，SNAI1在 1 d 時的 mRNA 表達量極顯著上升，而后各時間點的mRNA 表達量都呈現(xiàn)不同程度的下降，2、4 和 5 d 的 mRNA 表達量顯著下降；α-SMA在 1 d 時的 mRNA 表達量極顯著上升，而后各時間都呈現(xiàn)不同程度的下降，3 和4 d 的 mRNA 表達量顯著下降；E-cadherin在 2、3和 5 d 的 mRNA 表達量都顯著下降；β-catenin的mRNA 表達量在不同時間點均無顯著變化。

3 討論

本研究所用細胞為人正常支氣管上皮細胞，其發(fā)生EMT 為Ⅱ型EMT-組織纖維化。免疫熒光及形態(tài)學觀察證實細胞形態(tài)發(fā)生改變，與對照組相比，10 ng/mL TGF-β1 處理組細胞伸展狀態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)榧忓N形，從這種意義上來說，由TGF-β1 誘導的HBEC 發(fā)生的EMT屬于Ⅱ型EMT。細胞從接收刺激到做出反應(yīng)需要一定的時間。本研究實驗結(jié)果表明，TGF-β1刺激HBEC 后，轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 分別在3 h 和1 d做出了響應(yīng)（圖3C 和圖4C）。SNAI1在 3 h 時mRNA 水平的上調(diào)，可能與SNAI1 所調(diào)控應(yīng)激性基因的表達有關(guān)；TGF-β1 刺激細胞 1 d 時，SNAI1的mRNA 表達量增加到對照組的2.5 倍左右（圖4C）。這提示我們，由SNAI1 調(diào)控的靶基因可能會隨之升高或降低其表達量。SNAI1 通過結(jié)合E-box 抑 制 E-cadherin 的 轉(zhuǎn) 錄[14]。 結(jié) 果 表 明 ，E-cadherin的 mRNA 表達量在 TGF-β1 處理細胞 2、3和5 d 時均顯著下降，雖然在TGF-β1 刺激4 d時，較對照沒有顯著差異（圖4D）。

圖4 TGF-β1 處理 HBEC 0～5 d EMT 標志基因 mRNA 的表達量

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1 刺激6 h 內(nèi)，α-SMA和β-catenin的 mRNA 表達量均顯著降低（圖3A 和圖3B），E-cadherin的 mRNA 表達量在 6 h 時顯著升高（圖3D）。這似乎與EMT 的發(fā)生需要一定的時間有關(guān)。在本研究TGF-β1 刺激0～5 d 的時間范圍內(nèi)，SNAI1和α-SMA的 mRNA 表達水平先升高后下降（圖4C 和圖4A），E-cadherin的mRNA 表達量在 2、3 和 5 d 都顯著下降（圖4D），標志著EMT 的發(fā)生；在4 d 時無差異，原因可能是發(fā)生刺激后首先響應(yīng)應(yīng)答，而后隨著刺激時間的延長，正常細胞具有一定的自我調(diào)節(jié)修復(fù)能力，通過自我調(diào)節(jié)修復(fù)能力回到正常表達水平。而β-catenin的mRNA 表達量并未發(fā)生改變（圖4B），推測是β-catenin 在細胞中表達位置發(fā)生改變，由細胞質(zhì)更多地進入細胞核，總含量不變。

EMT 在腫瘤診斷、分期和治療中都有著重要作用。加深對EMT 相關(guān)調(diào)控因子的研究，不僅有助于更好地理解EMT 發(fā)生的機制，而且為了解腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的機制提供了新的思路，以EMT 為靶點的抗腫瘤新型藥物的研發(fā)也將是一個新的研究方向[15]。因此，深入探討EMT 相關(guān)調(diào)控因子，可為腫瘤治療提供新的線索，即通過抑制腫瘤細胞EMT 進程而降低腫瘤細胞的耐藥性，可作為腫瘤常規(guī)療法的補充，進而成為一種新的個性化腫瘤治療方法。