項(xiàng)浩特，王金琴，許 瑩，陳 芮

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500）

多糖是指由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖?，斂Ф嗵亲鳛楝斂У挠行С煞种?，具有重要的抗氧化活性。如瑪咖多糖可以清除 DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)、·OH(羥基自由基) 和O2-(超氧陰離子自由基)，對·OH具有顯著的抑制作用，但對O2-抑制率不高；瑪咖多糖在體外可顯著抑制CCl4引起的肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，減少M(fèi)DA(丙二醛)的產(chǎn)生，其抗氧化作用與Vc(維生素c)相似[1-3]?，斂Ф嗵沁€可通過提高機(jī)體SOD(超氧化歧化酶)活力、降低MDA含量、減少自由基堆積，加速體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的及時清除，從而起到延緩和抗疲勞的作用[4-6]。

瑪咖多糖的生物活性引起了研究者極大的興趣。陳艷青報(bào)道了提取溫度、提取時間、固液比等因素對采用水提醇沉法提取瑪咖多糖的提取率的影響[7]。浦躍武等首先比較了超聲波、熱水和微波法提取瑪咖多糖的效果及液料比、溫度、時間、功率等因素對提取瑪咖多糖的影響，最后采用正交實(shí)驗(yàn)得到超聲波提取瑪咖多糖的最佳工藝條件[2]。陳燕文等研究了分步醇沉法對瑪咖多糖的單糖組成及抗氧化活性的影響[4]。徐娟等報(bào)道了提取溫度、超聲時間、料液比對黑瑪咖中多糖得率的影響[8]。

本文采用紅外光譜法研究了提取溫度和時間對水提醇沉法得到的瑪咖多糖結(jié)構(gòu)的影響；采用紫外-可見吸收光譜法研究了提取溫度和時間對瑪咖多糖提取率的影響，得到了提取瑪咖多糖最佳的實(shí)驗(yàn)條件。該研究思路為瑪咖多糖進(jìn)一步分離純化及結(jié)構(gòu)研究提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-8000s型紫外-可見分光光度計(jì)（上海菁海儀器有限公司）；ALPHA-Ⅱ型紅譜儀（德國布魯克·道爾頓公司）。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用到的試劑均為分析純；所用香格里拉瑪咖購于云南省昆明市豐熙茶行。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 瑪咖多糖的提取

稱取瑪咖塊根粉末10 g，按1∶20 (w/v)的比例加入蒸餾水在不同溫度和時間進(jìn)行提取，隨后離心分離提取液。將上層清液濃縮至原來體積的1/5，冷卻。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7，加入0.4 g α-淀粉酶。于60℃水浴中酶解4h后，迅速升溫至100℃滅酶5min，離心分離沉淀。在上清液中加入乙醇溶液至乙醇濃度為80%，在4℃下沉淀12h，得棕黃色的沉淀。沉淀溶于40mL蒸餾水中，用Sevag法除蛋白后再醇析一次，將得到的沉淀用乙醚、丙酮各洗滌2次。將沉淀于50℃真空干燥5h，即得瑪咖多糖。

Sevag法除蛋白：移取瑪咖多糖溶液100mL，按5:1的體積比加入三氯甲烷-正丁醇混合液，振搖30min，經(jīng)離心分離后吸取上清液。重復(fù)此過程，直至瑪咖多糖稀釋液在260～280 nm沒有吸收峰出現(xiàn)，即表明提取物中的蛋白質(zhì)已除盡。

2.2 定性分析

采用壓片法將瑪咖多糖粉末和KBr在壓片機(jī)上壓成薄片，在紅外光譜儀上進(jìn)行測試，測試的波數(shù)范圍為 600～4000cm-1。

2.3 定量分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密配制0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，從中取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL 于 25mL 比色管中，再補(bǔ)足水分至2.4mL，加入6%的苯酚溶液1mL和濃硫酸 5mL，煮沸 15min。水中冷卻5min。以2.4mL水作為空白按照同樣的方法操作，用1cm比色皿于490nm處測吸光度A值。以濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 換算因子的測定

精密稱取瑪咖多糖2mg，定容至500mL，搖勻。精密吸取2.0mL按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測吸光度。

2.3.3 瑪咖多糖含量的測定

精確稱取瑪咖粉末0.05000g，按1∶20的比例加入蒸餾水。在60℃下，超聲提取20min后，離心分離清液，洗滌沉淀1次，合并濾液，過濾并定容至100mL。再移取4mL稀釋后的濾液定容至10mL。移取1mL置于25mL比色管中，加入1.0mL6%的苯酚溶液和5mL濃硫酸混勻后煮沸15min顯色，冷卻5min后，于490nm下測定吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜法分析

采用紅外光譜法考察了提取溫度和時間對提取得到的瑪咖多糖結(jié)構(gòu)的影響。圖1給出了90℃下不同提取時間時得到的瑪咖多糖的紅外光譜圖。

結(jié)果表明：采用該法得到的樣品在1116.06cm-1處存在很強(qiáng)的C-O-C單鍵不對稱伸縮振動吸收峰；在1407.30cm-1處存在O-H單鍵面內(nèi)彎曲振動吸收峰,這表明樣品中含有-COOH。在1625.87cm-1處有很強(qiáng)的C=O雙鍵伸縮振動吸收峰；在2936.56cm-1處有-CH2-不對稱伸縮振動吸收峰；在3381.73cm-1處有很強(qiáng)的聚合物的OH單鍵的伸縮振動吸收峰。另外，樣品在539.57cm-1和620.67cm-1的吸收峰對應(yīng)于C-O單鍵的伸縮振動及各種基團(tuán)的面內(nèi)變形振動。從圖中可知：提取溫度90℃，提取1h～3h時，得到的瑪咖多糖的紅外吸收光譜圖相似。

圖1 在90 oC不同提取時間時得到的瑪咖多糖的紅外光譜

圖2給出了溫度分別為70℃和90℃時提取時間為2h得到的瑪咖多糖的紅外光譜圖。由圖2可知：這兩種溫度下得到的瑪咖多糖的紅外吸收光譜圖相似。結(jié)果表明，提取溫度在70～90℃時，得到的瑪咖多糖的結(jié)構(gòu)不隨提取溫度變化而發(fā)生變化。

圖2 提取時間2h不同提取溫度時瑪咖多糖的紅外光譜

3.2 紫外吸收光譜法分析

采用紫外吸收光譜法分析了不同提取溫度和時間對瑪咖多糖提取率的影響。

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3給出了以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度c為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=11.85c-4.18×10-4，R2=0.997 (n=6)，表明在17～100μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 換算因子的測定結(jié)果

換算因素的計(jì)算公式為：

式中：W為試樣多糖的質(zhì)量；C為試樣多糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度；D為供試液的稀釋因素。

測得吸光度為0.341，計(jì)算得f=1.74。

3.2.3 瑪咖多糖提取率的測定及其對提取條件的影響

將測得的吸光度帶入回歸方程中計(jì)算出瑪咖干粉葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)（2） 計(jì)算瑪咖干粉中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

瑪咖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

式中：C為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度；D為供試液的稀釋因素；f為換算因數(shù)；W為瑪咖干粉的質(zhì)量。

提取率按照（3）計(jì)算：

從圖4中可知，隨著提取溫度的升高和提取時間的增加，瑪咖多糖的提取率降低。如在70℃下提取1h，瑪咖多糖的提取率為17.13%；提取2h的提取率為15.52%；提取3h的提取率為12.92%。在90℃下提取1h的提取率為12.42%；提取2h的提取率為11.93%；提取3h的提取率為11.01%。通過對比發(fā)現(xiàn)：在70℃下提取1h得到的瑪咖多糖的提取率最高。

綜合考慮提取溫度和時間對瑪咖多糖結(jié)構(gòu)及提取率的影響，認(rèn)為提取瑪咖多糖的最佳條件為提取溫度70℃，提取時間1h。

4 結(jié)語

圖4 提取溫度和時間對瑪咖多糖提取率的影響

本文采用紅外光譜法分析了提取溫度和提取時間對瑪咖多糖結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：提取溫度相同時，提取時間1h～3h，得到的瑪咖多糖的結(jié)構(gòu)相似；提取時間相同時，提取溫度在70℃～90℃，提取溫度對瑪咖多糖的結(jié)構(gòu)無影響。采用紫外-可見吸收光譜法研究了提取溫度和提取時間對瑪咖多糖提取率的影響，得到提取瑪咖多糖的最佳條件為溫度70℃時提取1h。