劉小莉　王榮　王帆　崔晉　周劍忠

摘要：研究不同溫度和pH值條件對白魚內(nèi)源性蛋白酶活性及其降解肌原纖維蛋白的影響。結(jié)果表明，鈣蛋白酶殘余活性在不同溫度和pH值條件下差異較大，在溫度為4、10、20、37 ℃條件下放置20 h后殘余活性分別為94.5%、63.2%、43.9%、47.1%;在pH值為4.50、5.00、5.50、6.89條件下放置20 h后殘余活性分別為94.62%、77.86%、31.36%、60.04%。在不同溫度和pH值條件下組織蛋白酶D變化幅度次于鈣蛋白酶，而組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大。SDS-PAGE結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，白魚肌肉肌球蛋白重鏈降解程度增加，而在pH值為5.00、5.50條件下肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的降解均很明顯。綜合考慮生產(chǎn)實際，最佳操作環(huán)境溫度為10～20 ℃、腌制液pH值為4.5。

關(guān)鍵詞：白魚;溫度;pH值;內(nèi)源酶;肌原纖維蛋白

中圖分類號： TS254.4

文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0188-04

收稿日期：2018-10-10

作者簡介：劉小莉（1981—），女，江蘇泰興人，博士，研究員，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：liuxljaas@hotmail.com。

通信作者：周劍忠，博士，研究員，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：zjzluck@126.com。

白魚（Culter alburnus）學(xué)名翹嘴紅鲌，別稱翹白、白條等，隸屬鯉科鲌亞科紅鲌屬[1]，肉質(zhì)鮮嫩美味而不腥，營養(yǎng)價值高，為魚中上品，是我國南北水域常見的淡水經(jīng)濟魚類。白魚肉質(zhì)非常細(xì)嫩[2]，保鮮儲運比較困難，因此白魚的加工對擴大其消費市場尤為重要。

淡水魚肌肉中水分含量高，蛋白豐富，宰殺僵直后魚肉新鮮度下降與很多復(fù)雜的因素有關(guān)，除了微生物引起的腐敗，還與其他生化、物理、結(jié)構(gòu)方面的改變有關(guān)[3]。在加工初期或冰藏過程中通常發(fā)生由內(nèi)源性蛋白酶催化的肌原纖維蛋白降解，導(dǎo)致肌肉軟化、品質(zhì)劣變等。肌原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)中重要結(jié)構(gòu)蛋白的水解以及肋節(jié)和中間絲蛋白的水解，都與組織軟化有關(guān)[4]。通常認(rèn)為，降解肌原纖維等蛋白的系統(tǒng)是鈣激活蛋白酶-鈣蛋白酶抑制蛋白系統(tǒng)和溶酶體組織蛋白酶-胱蛋白抑制系統(tǒng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉組織蛋白降解過程中起主要作用的酶包括鈣蛋白酶和組織蛋白酶B、L、D，它們可誘導(dǎo)宰后機體肌原纖維蛋白發(fā)生變化，對結(jié)構(gòu)軟化和生物活性肽釋放具有很大的影響[6]。一般認(rèn)為，鈣蛋白酶主要在宰后儲藏的早期造成有限的肌原纖維蛋白降解，而組織蛋白酶具有在后期降解肌動蛋白和肌漿球蛋白的能力。本研究以太湖白魚為研究對象，考察加工過程中不同操作環(huán)境溫度和腌制液pH值條件對白魚肌肉中內(nèi)源酶活性及其肌原纖維蛋白降解的影響，以期為白魚的加工研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料為鮮活白魚，購于江蘇省南京市玄武區(qū)集貿(mào)市場，平均質(zhì)量為（500±50） g/條。

主要試劑為酶活性檢測試劑盒（Biovision，USA，鈣蛋白酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L測定試劑盒貨號分別為K240-100、K140-100、K143-100、K142-100），其他試劑均為分析純，購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要設(shè)備有T25高速勻漿機（德國IKA公司）、infinite M200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、SDS-PAGE電泳儀（BIO-RAD公司）、離心機（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、pH值計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、低溫恒溫水浴鍋（南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 參照Nie等的方法[7]對白魚肌肉中內(nèi)源酶及肌原纖維蛋白進行提取：購買鮮活白魚，30 min內(nèi)帶回實驗室宰殺，去頭尾、皮、大刺后，取背部肌肉20 g置于50 mL離心管中，加220 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，靜置30 min后，在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，留上清。向沉淀中再加入20 mL水，重復(fù)提取1次，合并2次上清，得到肌漿蛋白提取液，即內(nèi)源酶粗酶液。

向上述所得沉淀中加入20 mL 4 ℃預(yù)冷的 0.05 mmol/L 磷酸緩沖液（pH值=7.2）（向其中補充 0.6 mol/L NaCl），12 000 r/min 勻漿30 s，在 10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集上清液。沉淀用上述步驟再重復(fù)提取1次，合并上清即為肌原纖維蛋白提取液。

1.3.2 不同處理對內(nèi)源酶活性的影響

1.3.2.1 溫度對內(nèi)源酶活性的影響 取10 mL內(nèi)源酶粗酶液置于試管中，分別在4、10、20、37 ℃條件下進行水浴，分別于水浴0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 h時取樣，測定酶活性;

1.3.2.2 pH值對內(nèi)源酶活性的影響 采用乙酸調(diào)節(jié)內(nèi)源酶粗酶液pH值至4.5、5.0、5.5，另外以不調(diào)節(jié)pH值（6、8P）的樣品作為對照，在37 ℃條件下進行水浴，分別于水浴0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 h取樣，測定酶活性;

1.3.3 肌原纖維蛋白的降解 采用“1.3.2”節(jié)中不同溫度和pH值處理后的肌漿蛋白提取液，與肌原纖維蛋白提取液按體積比1 ∶1進行混合，37 ℃水浴2 h后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE），采用考馬斯亮藍R-250染色2 h后，用脫色液脫色過夜，觀察成像。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對肌原纖維蛋白降解及蛋白酶活性的影響

2.1.1 溫度對內(nèi)源酶殘余酶活性的影響 由圖1可知，與其他組織蛋白酶相比，鈣蛋白酶殘余活性受溫度影響最大，在溫度為4 ℃下存放初期（0.5 h內(nèi)）殘余活性有上升趨勢，其他溫度條件下殘余活性均總體呈下降趨勢，20 h后，4、10、20、37 ℃條件下鈣蛋白酶殘余活性分別為94.5%、63.2%、43.9%、47.1%。在4、10、20、37 ℃條件下，組織蛋白酶D活性變化幅度次于鈣蛋白酶，處理20 h后殘

余酶活性分別為72.6%、60.5%、55.3%、50.1%，而組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大，處理20 h后活性范圍分別為45.0～52.0%、49.0～55.0%。4 ℃低溫加工條件可以明顯抑制酶活性，當(dāng)恢復(fù)到最適測定溫度條件時測得的殘余酶活性反而較其他溫度條件下的殘余酶活性明顯增大。組織蛋白酶L也呈現(xiàn)類似的趨勢。

2.1.2 溫度對肌原纖維蛋白降解作用的電泳圖譜 由圖2可知，隨著溫度升高，肌動蛋白沒有發(fā)生明顯變化，但在37 ℃時，肌球蛋白重鏈逐漸模糊，說明肌原纖維蛋白開始降解。在4、10 ℃條件下肌原纖維蛋白未見明顯的降解，說明低溫加工條件能有效抑制內(nèi)源酶對肌原纖維蛋白的降解作用，進一步驗證了圖1中4種酶的殘余活性結(jié)果。溫度越低，對白魚肌肉中內(nèi)源酶活性的抑制效果越好，但考慮到生產(chǎn)實際條件，4～10 ℃的操作環(huán)境溫度不易實現(xiàn)，因此選擇10～20 ℃ 為最佳操作溫度范圍。

2.2 pH值對肌原纖維蛋白降解及蛋白酶活性的影響

2.2.1 pH值對內(nèi)源酶殘余酶活性的影響 由圖3可知，不同酶受pH值影響的變化趨勢與溫度類似，不同pH值條件下鈣蛋白酶殘余酶活性差異最大，在pH值為4.50、5.00、5.50、6.89條件下處理20 h后殘余酶活性分別為94.62%、77.86%、31.36%、60.04%;其次是組織蛋白酶D，而組織蛋白酶B、L差異較小。鈣蛋白酶最適pH值為6.9～7.5，組織蛋白酶B、L屬于半胱氨酸蛋白酶，大多半胱氨酸蛋白酶的最適pH值為7.0～8.0[8]，而組織蛋白酶D是一種天冬氨酸蛋白酶，其最適pH值在5.0以下[9-10]。未經(jīng)過pH值調(diào)節(jié)的對照組pH值為6.89，在自然pH值條件下各種蛋白酶的活性下降相對較快。處理20 h后，B、D、L的殘余活性在pH值為5.50、4.50、6.89、5.50條件下鈣蛋白酶與組織蛋白酶最低。

2.2.2 pH值對肌原纖維蛋白降解作用的電泳圖譜 由圖4可知，在pH值為5.00、5.50條件下，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的降解均很明顯，結(jié)合殘余酶活性測定結(jié)果可以推斷組織蛋白酶D可能是引起肌原纖維蛋白降解的主要原因。在以往的研究報道中，對肌原纖維蛋白降解具有影響的蛋白酶種類各不相同。李樹紅等研究了漂洗后鰱魚魚糜中組織蛋白酶的殘留情況，認(rèn)為溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶在鰱魚魚糜凝膠軟化中起一定作用，其中組織蛋白酶L可能是重要的蛋白水解酶[11]。鐘嬋等研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B參與藍圓鲹肌原纖維蛋白的降解，更可能參與在低pH值條件下魚糜凝膠劣化[12]。

3 結(jié)論

在不同溫度和pH值條件下對白魚內(nèi)源性蛋白酶殘余活性及其對肌原纖維蛋白降解的情況進行研究，結(jié)果表明，低溫和低pH值加工條件可以明顯抑制內(nèi)源性蛋白酶的活性，特別是鈣蛋白酶殘余活性在不同溫度和pH值條件下差異較明顯，其次為組織蛋白酶D，組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大，低溫和低pH值條件能明顯延緩肌原纖維蛋白的降解，結(jié)合生產(chǎn)實際，最佳操作環(huán)境溫度為 10～20 ℃、腌制液 pH值為4.5。

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