張 霞 許曼琳 于 靜 吳菊香 李 瑩 鄢洪海 李長友王曉強郭志青*遲玉成*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,山東 青島 266101)

花生在世界上許多地區(qū)都有種植,中國和印度為主要的生產(chǎn)國,其次是蘇丹和尼日利亞[1]。花生占我國所有油料作物總產(chǎn)量的46%以上[2]。花生冠腐病是危害花生的重要病害之一,危害果仁、子葉和莖基部,以莖基部為主[3]。花生冠腐病又叫黑霉病、曲霉病、黑曲霉病和少亡病等[4],最早由Jochem 于1926 年首次報道了冠腐病在花生上的危害[5],該病是由黑曲霉(Aspergillusnigerv.Tiegh.)侵染引起的一種土傳性真菌病害[6]。該病害可在感染花生種子中存活,通過種子傳播[7],儲藏期潮濕的種仁易受病菌感染,種子帶菌率高達90%以上[8]。土壤帶菌是另一種重要初侵染源,病菌可在土壤中存活1～2年[9]。花生冠腐病在印度和美國嚴重發(fā)生,每年引起花生產(chǎn)量損失5%左右,嚴重地區(qū)達40%[10]。在我國,冠腐病之前僅零星發(fā)生,不會造成重大經(jīng)濟損失,近些年重茬和抗病品種的匱乏導(dǎo)致病原菌連年累積,導(dǎo)致病害發(fā)生越發(fā)嚴重[11],一般造成缺苗10%左右,嚴重的在50%以上[12]。

針對花生冠腐病的防治工作,主要從種子處理和土壤處理兩個方面著手。除輪作、加強田間管理等農(nóng)業(yè)措施和種植抗病品種外,化學(xué)防治是控制土傳病害的最有效措施。雖然目前國內(nèi)尚無登記用于防治花生冠腐病的藥劑,但也不乏研究者。李楊等[11]通過比較咪鮮胺、戊唑醇、醚菌酯、多·福對冠腐病的防治效果,發(fā)現(xiàn)戊唑醇在播種期或團棵期處理防效達到77%以上。苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈包衣花生種子,對花生冠腐病和根腐病田間防效均在75%以上,由此增加產(chǎn)量[13]。雖然化學(xué)防治的優(yōu)勢有目共睹,但是由于人類健康和環(huán)境問題,尋找化學(xué)農(nóng)藥的替代品引起人們的關(guān)注[14],使用微生物控制植物病害是一個很好的選擇[15]。如陽陵鏈霉菌3-10能夠有效控制黃曲霉對花生的侵染,并能減少黃曲霉毒素的積累[16];短小芽孢桿菌LX11對白絹病菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性,同時田間防效超過65%[17];多粘芽孢桿菌不但有效降低了冠腐病的發(fā)病率,還促進植物生長,增加產(chǎn)量[14]。

本研究使用的生防菌株ZHX-10從花生田中分離得到,對白絹病菌具有很好的拮抗作用[18]。試驗測試了ZHX-10對冠腐病菌的拮抗作用,旨在為花生冠腐病的生物防治尋找有效的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

本試驗所用的花生品種為花育917,由山東省花生研究所培育保存。

1.1.2 菌株

花生冠腐病菌菌株(A.niger)由本研究室分離保存。暹羅芽胞桿菌ZHX-10菌株(保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No.15609)由本研究室分離保存。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基的配制參考方中達的方法[19]。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 ZHX-10和花生冠腐病菌平板對峙培養(yǎng)實驗

花生冠腐病菌的活化:取5 μL花生冠腐病菌的保存液,接種到PDA 培養(yǎng)基中央,25℃暗培養(yǎng)7 d,備用。ZHX-10菌液的活化:挑取ZHX-10的單菌落,在LB 液體培養(yǎng)基中活化,150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)12 h,離心后制備菌懸液,備用。吸取5 μL ZHX-10菌懸液,接種于PDA 固體培養(yǎng)基中央,28℃恒溫培養(yǎng)24 h后,向PDA 培養(yǎng)基中均勻噴施冠腐病菌的孢子懸浮液。以不接種菌懸液為對照,每處理重復(fù)6次,25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d,測量抑菌圈直徑大小。

1.2.2 ZHX-10揮發(fā)性氣體抑菌活性測定

采用二分皿法測定揮發(fā)性氣體的抑菌活性[20]。按照1.2.1的方法制備ZHX-10的菌懸液,并均勻涂布在二分格培養(yǎng)皿LB培養(yǎng)基側(cè),另一PDA 培養(yǎng)基側(cè)中央位置接種10 μL冠腐病菌的孢子懸浮液,涂布50 μL無菌水為對照組,每處理重復(fù)6次。5 d后測量菌落直徑,計算相對抑菌率。

相對抑菌率/%=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100

1.2.3 ZHX-10發(fā)酵液抑菌活性測定

將ZHX-10 的單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)24 h,10000 r/min離心10 min,收集上清液,用直徑0.22 μm 濾膜過濾除菌。將無菌培養(yǎng)濾液以1:10的比例與加熱冷卻至40～50℃的PDA培養(yǎng)基混勻后倒平板,在平板中央接入10 μL冠腐病菌的孢子懸浮液,以添加等量LB培養(yǎng)基的平板為對照,每處理重復(fù)6次。25℃黑暗培養(yǎng),7 d后測量菌落直徑,計算相對抑菌率。

1.2.4 ZHX-10對花生生長的影響

將高油酸花生花育917種子消毒后,浸泡于用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的ZHX-10菌液中,以浸泡于LB培養(yǎng)基中為對照。4 h后,播種于含ZHX-10菌液的滅菌基質(zhì)中,以添加LB的基質(zhì)為對照。每個處理重復(fù)3次,每個重復(fù)20粒種子。播種后7 d觀測出苗率,15 d觀測成苗率,30 d測定植株總鮮質(zhì)量和總干質(zhì)量(105℃殺青30 min,80℃烘干至恒質(zhì)量)。

1.2.5 ZHX-10對花生冠腐病的防治

按1.2.4的方法培育花生苗,播種7 d后接種冠腐病菌的孢子懸浮液,14 d后調(diào)查發(fā)病情況。病害分級標準參考李楊等的0～4級的分級標準[11]。

病株率/%=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×對應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù))×100

防治效果/%=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

圖1 ZHX-10對冠腐病菌拮抗活性的測定Fig.1 Analysis of antibiotic activity of ZHX-10 against A.niger

1.2.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行處理,差異顯著性采用Duncan’s新復(fù)極差法測驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZHX-10對冠腐病菌絲生長的影響

由圖1可看出,ZHX-10菌株對冠腐病菌具有顯著的抑菌效果,抑菌圈直徑24.3±1.21 mm。

2.2 ZHX-10揮發(fā)性氣體對冠腐病菌菌絲生長的影響

由圖2可看出,同對照相比,ZHX-10的揮發(fā)性氣體極顯著降低了冠腐病菌的生長,菌絲生長抑制率達16.47%,可見ZHX-10 揮發(fā)性氣體對冠腐病菌菌落生長具有抑制效果。

2.3 ZHX-10發(fā)酵液對冠腐病菌菌絲生長的影響

由圖3可看出,同對照相比,無菌濾液極顯著減緩了冠腐病菌菌絲生長,抑制率達8.28%。說明ZHX-10的發(fā)酵液對冠腐病菌菌落生長具有一定的抑制效果。

2.4 ZHX-10對花生幼苗生長的影響

從表1可看出,對照組中花育917出苗率為93.33±2.89%,成苗率為96.49±3.04%;而ZHX-10處理的花生出苗率為96.67±2.89%,成苗率為100.00±0.00%,兩者無顯著差異,但ZHX-10極顯著增加了花育917植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量,分別提高34.69%和28.44%。

圖2 ZHX-10揮發(fā)性氣體對冠腐病菌的抑菌作用Fig.2 The inhibitory effect of

圖3 ZHX-10無菌發(fā)酵液對冠腐病菌的影響Fig.3 Effects of ZHX-10 culture

表1 ZHX-10對花生苗期生長的影響Table 1 Effects of ZHX-10 on peanut seedling growth

表2 ZHX-10對花生冠腐病的防治效果Table 2 Control effect of ZHX-10 against peanut crown rot

2.5 ZHX-10對花生冠腐病的生物防治

從表2可看出,對照組和處理組發(fā)病率都為100%,同對照相比,ZHX-10 處理的死亡率和病情指數(shù)均極顯著降低,死亡率降低了85.71%,防效達到52.04%。

3 討論與結(jié)論

細菌由于具有分布廣、種類多、繁殖快、易培養(yǎng)、作用方式多樣等特點,是最具有生防潛力和應(yīng)用價值的微生物[21],其中以對芽孢桿菌的研究最為普遍[22],芽孢桿菌的生物防治能力主要通過抑制植物病原菌的生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、同病原菌競爭生態(tài)位來實現(xiàn)[23]。國內(nèi)外在開發(fā)和利用芽孢桿菌進行生物防治方面進行了廣泛研究。厲彥芳等發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌B8及其發(fā)酵液能促進番茄生長并抑制番茄黃化曲葉病毒[24],貝萊斯芽孢桿菌在實驗室和溫室環(huán)境中均表現(xiàn)出對番茄細菌性枯萎病和香蕉枯萎病具有拮抗活性[25],阿氏芽胞桿菌H26-2 和暹羅芽孢桿菌H30-3既可以促進白菜生長,又可以緩解高溫和干旱脅迫[26]。本研究所用的生防菌株ZHX-10為暹羅芽胞桿菌,可高效抑制冠腐病菌。

ZHX-10的菌懸液、揮發(fā)性氣體、發(fā)酵液對冠腐病菌具有一定抑制效果,揮發(fā)性氣體的抑菌率為發(fā)酵液的2倍,推測ZHX-10的抑菌物質(zhì)在菌體、發(fā)酵液和揮發(fā)性氣體中都有分布。雖然暹羅芽胞桿菌在促進花生生長、防治花生冠腐病方面鮮有報道,但是其他細菌方面有很多研究。如多粘芽孢桿菌不但有效降低了冠腐病的發(fā)病率,還促進植物生長,增加產(chǎn)量[14];枯草芽孢桿菌AF1促進花生生長,減輕冠腐病發(fā)病情況[27];銅綠假單胞菌GSE 18-R1促進花生生長,減輕冠腐病發(fā)病情況[28];木霉菌JAU60減少冠腐病約50%發(fā)生率[29]。灌根處理發(fā)現(xiàn),ZHX-10能夠促進花生生長,接種冠腐病菌后能降低冠腐病的病情指數(shù),表現(xiàn)出明顯的抗性,防效超過52%。

菌株ZHX-10能夠產(chǎn)生某些高效的抑菌活性物質(zhì),可能是幾種物質(zhì)的單一作用,也可能是多種物質(zhì)的協(xié)同作用,具體種類、結(jié)構(gòu)、特性以及抑菌機理等尚不明確,還需進一步研究。這些數(shù)據(jù)為今后暹羅芽胞桿菌ZHX-10的在花生上防治冠腐病菌方面提供了研究基礎(chǔ)。