譚曾勇，冉 勤，胡瓊丹，趙詩(shī)蘭，馮漢清，楊 艷

(湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，尤其在水果、蔬菜、茶、種子以及植物根部含量豐富。黃酮類化合物具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)[1-3]，雖不屬于維生素，但由于其在生物體內(nèi)反應(yīng)的重要作用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被稱為“維生素P”[4-7]。大多數(shù)黃酮類化合物具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、解肝毒等功效[8-10]。蔓生草本植物絞股藍(lán)富含黃酮類化合物，屬藥食同源植物，在明朝就被載入《救荒本草》，含人參皂苷等數(shù)十種活性成分。國(guó)內(nèi)外大量科研機(jī)構(gòu)和臨床試驗(yàn)證明[11-14]，絞股藍(lán)具有顯著降血脂、凈化血液、穩(wěn)定血壓、延年駐顏等功效；同時(shí)對(duì)提高睡眠質(zhì)量、防治便秘、消暑解渴、增強(qiáng)免疫、保肝護(hù)肝等都有很好療效；還可緩解因吸煙、飲酒過(guò)度等帶來(lái)的不適[15-17]。文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道，提取工藝對(duì)絞股藍(lán)總黃酮的提取量及抗氧化活性影響較大。因此，作者采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)測(cè)定其對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

某品牌野生龍須絞股藍(lán)，購(gòu)于恩施市中百倉(cāng)儲(chǔ)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)008029705)，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、維生素C，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵、雙氧水，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；三羥甲基氨基甲烷，四川西亞化工有限公司；濃鹽酸，武漢洪山中南化工試劑有限公司；焦性沒(méi)食子酸，天津博迪化工有限公司；水楊酸，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；二次蒸餾水。所用試劑均為分析純。

UV-2550型紫外分光光度儀，SHIMADZU；D1S型集熱式磁力攪拌器，上海予正儀器設(shè)備有限公司；FA1004B型電子天平，上海佑科儀表有限公司；800型離心機(jī)，上海云樓醫(yī)用儀器廠；KQ 2200B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DW-2型調(diào)溫電熱器，江蘇通州光學(xué)儀器有限公司。

1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為溶劑，以氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁為顯色劑，分別繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液及絞股藍(lán)提取液的吸收曲線。結(jié)果顯示，絞股藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為505 nm。由于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在500～510 nm之間吸光度相差不大，因而后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及絞股藍(lán)提取液中總黃酮的測(cè)定均以505 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[7]配制0.200 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中；加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6 min；加入0.3 mL配制好的10%硝酸鋁溶液，靜置60 min；加入4 mL配制好的4%氫氧化鈉溶液，靜置15 min；用60%乙醇定容至刻度，靜置15 min；測(cè)定其在505 nm處吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 提取工藝的優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

主要考察提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、pH值、提取次數(shù)等對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)提取時(shí)間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%，固液比為1∶10(g∶mL，下同)、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，pH值為3、5、7、8、10，提取次數(shù)為1、2、3、4。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

為了更好地進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，分別對(duì)比了回流法及索氏提取法提取絞股藍(lán)總黃酮的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索氏提取法提取的絞股藍(lán)總黃酮提取量更高，因此，正交實(shí)驗(yàn)采用索氏提取法提取絞股藍(lán)總黃酮。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、pH值、虹吸次數(shù)為考察因素，以絞股藍(lán)總黃酮提取量為指標(biāo)，采用L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化絞股藍(lán)總黃酮提取工藝。

1.5 抗氧化活性的評(píng)價(jià)

1.5.1 對(duì)羥基自由基的清除效果

水楊酸能捕捉羥基自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。若在反應(yīng)體系中加入具有清除羥基自由基的物質(zhì)時(shí)，會(huì)使有色物質(zhì)生成量減少，溶液在510 nm處吸收峰強(qiáng)度會(huì)減弱或消失。

在10 mL容量瓶中依次加入9.0 mmol·L-1FeSO4溶液1.0 mL、9.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、8.8 mmol·L-1H2O2溶液1.0 mL；再分別量取1.0 mg·mL-1的絞股藍(lán)總黃酮提取液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL于容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，于37 ℃反應(yīng)30 min；用紫外分光光度儀測(cè)定溶液在510 nm處吸光度A樣品；樣底管不加H2O2溶液，空白管不加絞股藍(lán)總黃酮提取液，同法測(cè)定溶液在510 nm處吸光度A樣底、A空白，按式(1)計(jì)算清除率。取相同濃度VC溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)絞股藍(lán)總黃酮對(duì)羥基自由基的清除效果。

(1)

1.5.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果

鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成超氧陰離子自由基以及有色中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物在420 nm處有強(qiáng)吸收。若在反應(yīng)體系中加入具有清除超氧陰離子自由基的物質(zhì)時(shí)，超氧陰離子自由基的生成會(huì)受到抑制，溶液在420 nm處吸收峰強(qiáng)度減弱。

在10 mL容量瓶中加入pH值為8.2的0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，再分別加入1.0 mg·mL-1絞股藍(lán)總黃酮提取液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、2.0 mL，用蒸餾水稀釋到6.0 mL，搖勻，于25 ℃反應(yīng)20 min；再加入0.4 mL 6.0 mmol·L-1鄰苯三酚(含10 mmol·L-1HCl)，搖勻，于25 ℃反應(yīng)4 min；再滴2滴8.0 mol·L-1HCl終止反應(yīng)；用蒸餾水稀釋至刻度，用紫外分光光度儀測(cè)定溶液在420 nm處吸光度A樣品；樣底管用10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚，空白管不加絞股藍(lán)總黃酮提取液，同法測(cè)定溶液在420 nm處吸光度A樣底、A空白，按式(1)計(jì)算清除率。取相同濃度VC溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)絞股藍(lán)總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。擬合得線性回歸方程A=13.05421c+0.00885，R2=0.99963。表明，蘆丁濃度在0.010～0.080 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 最優(yōu)提取工藝

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖2)

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，絞股藍(lán)總黃酮提取量不斷升高，150 min后趨于穩(wěn)定。這可能是由于，提取一定時(shí)間后，原料中的黃酮類化合物基本被提取，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量不再升高。因此，最優(yōu)提取時(shí)間為150 min。

2.2.1.2 提取溫度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖3)

圖2 提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

圖3 提取溫度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，絞股藍(lán)總黃酮提取量不斷升高，在90 ℃時(shí)達(dá)到最高。因此，最優(yōu)提取溫度為90 ℃。

2.2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖4)

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，絞股藍(lán)總黃酮提取量先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)椋掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)大，絞股藍(lán)不能充分溶解，不利于黃酮類物質(zhì)的提取，導(dǎo)致提取量降低。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇60%較為適宜。

2.2.1.4 固液比對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖5)

圖5 固液比對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

由圖5可知，隨著固液比的減小，即溶劑用量的增加，絞股藍(lán)總黃酮提取量不斷升高，在料液比達(dá)到1∶50后趨于穩(wěn)定。這主要是由于，增加溶劑用量，有利于絞股藍(lán)中的黃酮類物質(zhì)向提取液中擴(kuò)散，從而提高總黃酮提取量；但當(dāng)溶劑用量增加到一定值時(shí)，絞股藍(lán)表面與提取液之間的濃度差不再是影響提取量的主要因素，此時(shí)溶劑溶解的蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)也會(huì)增多。因此，固液比選擇1∶50較為適宜。

2.2.1.5 pH值對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖6)

圖6 pH值對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

由圖6可見(jiàn)，隨著pH值的增大，絞股藍(lán)總黃酮提取量先升高后降低，在pH值約為8時(shí)達(dá)到最高；過(guò)酸條件下，提取量較低；過(guò)堿條件下，提取量下降明顯。這可能是由于，過(guò)酸和過(guò)堿環(huán)境都有可能破壞黃酮類物質(zhì)的成分，導(dǎo)致總黃酮提取量降低。因此，pH值選擇8較為適宜。

2.2.1.6 提取次數(shù)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響(圖7)

由圖7可知，提取2次時(shí)的絞股藍(lán)總黃酮提取量較提取1次時(shí)的提取量呈直線升高；提取3次時(shí)，提取量平緩上升；提取4次時(shí)，提取量則有下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)?，隨著提取次數(shù)的增加，提取時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，造成總黃酮出現(xiàn)分級(jí)現(xiàn)象，從而影響總黃酮提取量。因此，最優(yōu)提取次數(shù)為2次。

圖7 提取次數(shù)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

水平因素A.乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B.固液比/(g∶mL)C.pH值D.虹吸次數(shù)/次1 40 1∶30 4 12 2 60 1∶50 8 18 3 80 1∶70 10 24

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiments

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD提取量mg·g-11111156.4742122276.1133133379.0234212368.2065223165.5506231261.1427313257.9998321358.3139332169.542k170.53760.89358.64363.855 k264.96666.65971.28765.085 k361.95169.90267.52468.514 R8.5869.00912.6444.659

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性乙醇體積分?jǐn)?shù)113.82820.7916.940無(wú)固液比124.93220.8686.940無(wú)pH值252.90321.7576.940無(wú)虹吸次數(shù)34.97520.2436.940無(wú)誤差287.884

由表2、3可知，各因素對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響大小依次為：pH值>固液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>虹吸次數(shù)，最優(yōu)工藝組合為A1B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、固液比1∶70、pH值8、虹吸次數(shù)24。

在最優(yōu)提取條件下，采用索氏提取法提取絞股藍(lán)總黃酮， 2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的總黃酮提取量分別為83.296 mg·g-1、83.294 mg·g-1，平均值為83.295 mg·g-1。表明，該方法具有非常好的重復(fù)性，優(yōu)化的提取工藝是可行的。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對(duì)羥基自由基的清除率(圖8)

圖8 對(duì)羥基自由基的清除率

由圖8可知，隨著VC濃度的增加，其對(duì)羥基自由基的清除率迅速升高，當(dāng)VC濃度高于0.06 mg·mL-1時(shí)，清除率超過(guò)95.000%，增幅趨緩；隨著絞股藍(lán)總黃酮提取液濃度的增加，其對(duì)羥基自由基的清除率逐漸升高，當(dāng)絞股藍(lán)總黃酮提取液濃度達(dá)到0.18 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到56.757%。表明，絞股藍(lán)總黃酮提取液與VC對(duì)羥基自由基均具有一定的清除能力，VC對(duì)羥基自由基的清除效果更明顯。這是因?yàn)?，VC為人工合成品，純度高，其抗氧化活性相應(yīng)較高；而絞股藍(lán)未經(jīng)處理，提取得到的總黃酮為天然抗氧化劑，安全性高，且有些結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物抗氧化能力較差，因此，絞股藍(lán)總黃酮的抗氧化活性較VC差。

2.3.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除率(圖9)

圖9 對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

由圖9可知，隨著VC濃度的增加，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率迅速升高，當(dāng)VC濃度高于0.08 mg·mL-1時(shí)，清除率超過(guò)98.230%，增幅趨緩；隨著絞股藍(lán)總黃酮提取液濃度的增加，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，當(dāng)絞股藍(lán)總黃酮提取液濃度達(dá)到0.20 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到65.151%。表明，絞股藍(lán)總黃酮提取液和VC對(duì)超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果更明顯。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)測(cè)定其對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明：各因素對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響大小依次為：pH值>固液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>虹吸次數(shù)；最佳提取工藝為：提取時(shí)間150 min、提取溫度90 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、固液比1∶70(g∶mL)、pH值8、虹吸次數(shù)24，在此條件下，絞股藍(lán)總黃酮提取量達(dá)到83.295 mg·g-1；絞股藍(lán)總黃酮提取液和VC對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，但在相同濃度下，VC的抗氧化活性更高；當(dāng)絞股藍(lán)總黃酮濃度為0.18 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到56.757%；當(dāng)絞股藍(lán)總黃酮濃度為0.20 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到65.151%。