魯靜，陳天朝，馬彥江，牛曉靜

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的功效[1]。其炮制歷史悠久，方法較多，有炒、蒸、酒制、脂制等[2]，目前以《中國(guó)藥典》所收載的酒蒸法或酒燉法為主。山茱萸生品斂陰止汗力強(qiáng)，酒制后借酒力溫通，助藥勢(shì)，酸性降低，滋補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)[3]。

現(xiàn)代研究表明，山茱萸中含有環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、有機(jī)酸類和鞣質(zhì)類等成分[4]，其中環(huán)烯醚萜苷類成分莫諾苷、馬錢(qián)苷具有抗神經(jīng)退行性病變、抗血栓、抑制黑素、抗糖尿病等作用[5]。美拉德反應(yīng)是一類廣泛存在于中藥加工炮制過(guò)程中，以氨基化合物與羰基化合物為底物的非酶褐變反應(yīng)[6]，5-羥甲基糠醛是該反應(yīng)重要的中間產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗組織缺氧等藥理活性[7]。本課題組對(duì)其炮制前后馬錢(qián)苷、莫諾苷、還原糖及5-羥甲基糠醛(5-HMF)等成分的含量進(jìn)行對(duì)比研究，以探討酒蒸工藝對(duì)山茱萸有效成分的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

GZX-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；BSA224S-CW型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；JW-2018H型高速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Evolution201型紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)；Ultimate 3000型號(hào)高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 藥材與試劑

山茱萸(批號(hào)：1702091，產(chǎn)地浙江)由安徽普仁中藥飲片有限公司提供，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。馬錢(qián)苷(批號(hào)：111640-201005，含量99.2%)、D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：110833-201707，含量99.9%)(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；5-HMF(批號(hào)：A22J7L16607，含量≥98%)、莫諾苷(批號(hào)：Z12O8B45504，含量≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;黃酒(批號(hào)：20190110，度數(shù)10.0%,浙江古越龍山酒業(yè)有限公司);乙腈、磷酸為色譜純;甲醇、乙醇、硫酸等為分析純。

2 酒萸肉的制備

酒萸肉以酒蒸法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0213)制備。取山茱萸適量，加20%黃酒拌勻，潤(rùn)透，蒸至酒吸盡，取出，置于烘箱中在60 ℃烘干1.5 h，即得。

3 方法與結(jié)果

3.1 HPLC法測(cè)定5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量

3.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

采用Agilent 公司Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20 min，7% A；20～50 min，7%～20% A；50～50 min，7%～20% A)，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷混合對(duì)照品、山茱萸及酒萸肉的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

注：a對(duì)照品色譜圖,b山茱萸樣品色譜圖,c酒萸肉樣品色譜圖；1 5-HMF,2莫諾苷,3馬錢(qián)苷?qǐng)D1 高效液相色譜圖

3.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL分別含5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷0.377 mg、0.515 mg和0.500 mg的混合對(duì)照品溶液。

3.1.3 供試品溶液的制備

取山茱萸或酒萸肉樣品，粉碎，過(guò)3號(hào)篩。取粉末約0.2 g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷后再次稱定，補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾，濾液于5 000 r/min離心15 min，取上清液，即得。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于50 mL容量瓶，用50%甲醇水定容，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。按“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5-HMF的回歸方程為Y=0.149 3X+0.037，r=0.999 9，線性范圍為7.54～75.4 μg/mL，莫諾苷的回歸方程為Y=0.312 7X+0.091 1，r=0.999 9，線性范圍為10.3～103 μg/mL，馬錢(qián)苷的回歸方程為Y=0.279 7X+0.131 5，r=0.999 8，線性范圍為10.0～100 μg/mL。

3.1.5 精密度試驗(yàn)

取酒萸肉樣品制備的供試品溶液，按“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，共6次，5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷峰面積的RSD分別為0.5%、0.7%和0.8%，表明儀器精密度良好。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“3.1.3”的方法制備酒萸肉樣品的供試品溶液，共6份，按“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到的5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷含量的RSD分別為1.9%，1.8%和2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取酒萸肉樣品的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)行色譜測(cè)定。5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷峰面積的RSD分別為1.3%、1.2%和1.5%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取山茱萸或酒萸肉樣品，粉碎，過(guò)3號(hào)篩。取粉末約0.1 g，精密稱定，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液1 mL，按“3.1.3”制備供試品溶液，按“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷的平均回收率為98.3%、98%和97.9%，RSD為3.3%、3%和3.2%。

3.1.9 樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷含量的測(cè)定

取山茱萸、酒萸肉樣品，按“3.1.3”制備供試品溶液，按“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 山茱萸各樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量

3.2 DNS法測(cè)定還原糖的含量

3.2.1 DNS溶液的配制

取3，5-二硝基水楊酸6.5 g，加入少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，再加入2 mol/L的NaOH溶液325 mL、丙三醇45 g，混勻，用蒸餾水定容至刻度，即得。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加蒸餾水配制成濃度為1.00 4 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

3.2.3 供試品溶液的制備

取山茱萸或酒萸肉樣品，粉碎，過(guò)3號(hào)篩。取粉末約1.0 g，精密稱定，加水50 mL，攪勻，在水浴鍋中于50 ℃放置1 h。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管，于5 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀再加入水50 mL，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL，搖勻，即得。

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管，加水至1 mL，搖勻，再加入DNS溶液2 mL，混勻，在沸水浴中加熱5 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移并定容至25 mL。以蒸餾水為空白，在540 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.665 8C+0.001 1(R2=0.999 5)，結(jié)果表明，葡萄糖在200.8～100 4 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

3.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取酒萸肉樣品的供試品溶液，按“3.2.4”方法顯色，測(cè)定6次，吸光度的RSD為0.5%，表明儀器精密度良好。

3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“3.2.3”方法制備酒萸肉樣品的供試品溶液，共6份，按“3.2.4”方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算得到的還原糖含量的RSD為1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取酒萸肉樣品的供試品溶液，按“3.2.4”方法顯色，分別于5、10、15、20、25、30 min測(cè)定吸光度，RSD為0.8%，說(shuō)明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取酒萸肉樣品約0.5g，精密稱定，共6份，分別精密加入12.69 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液2 mL，按“3.2.3”方法制備酒萸肉樣品的供試品溶液，按“3.2.4”方法顯色，測(cè)定吸光度，還原糖的平均回收率為98.4%，RSD為3.7%。

3.2.9 還原糖含量的測(cè)定

精密量取供試品溶液1 mL，置于具塞試管中，加入DNS溶液2 mL，混勻，在沸水浴中加熱5 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移并定容至25 mL，在540 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算樣品中還原糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 山茱萸各樣品中還原糖的含量

4 討論

2015年版《中國(guó)藥典》一部山茱萸項(xiàng)下采用HPLC法測(cè)定莫諾苷和馬錢(qián)苷的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，5-HMF在240 nm處的吸光度雖不及最大吸收波長(zhǎng)284 nm處的吸光度，但能滿足定量測(cè)定要求，故最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

還原糖的測(cè)定方法主要有DNS法、MBTH法和鐵氰化鉀法等[8]，本試驗(yàn)采用較為常用的DNS法，該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定[9]?？疾炝瞬煌珼NS試劑用量(0.5、1、2、3、4、5 mL)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著用量的增加，吸光度值逐漸升高，用量超過(guò)2 mL，吸光度值趨于穩(wěn)定，因此，選擇DNS試劑的用量為2 mL。然后考察了不同加熱時(shí)間(2、5、10、15、20 min)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，吸光度值在加熱5 min時(shí)最高，加熱時(shí)間的持續(xù)增加對(duì)吸光度值影響不大，最終確定加熱時(shí)間為5 min。

研究結(jié)果表明，山茱萸炮制后生成了5-HMF，而馬錢(qián)苷、莫諾苷、還原糖的含量有所降低。5-HMF作為酒萸肉相對(duì)于生品新增的活性化合物，可能是酒萸肉滋補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)的原因之一[7,10]。本試驗(yàn)進(jìn)一步考察了蒸制時(shí)間對(duì)4種有效成分的影響，發(fā)現(xiàn)隨著蒸制時(shí)間的增加，酒萸肉中5-HMF的含量不斷增加，莫諾苷、還原糖的含量持續(xù)降低，馬錢(qián)苷的含量相對(duì)比較穩(wěn)定。因此，為控制酒萸肉的質(zhì)量，酒蒸的終點(diǎn)應(yīng)以“蒸至酒吸盡”為宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)影響成品的功效，變化較明顯的莫諾苷、還原糖、5-HMF等成分，可作為監(jiān)測(cè)炮制程度的指標(biāo)。