費(fèi) 潛，王燦莉，孫 勇

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)在2001年由法國(guó)科學(xué)家 Choukroun 等[1]發(fā)現(xiàn)，是繼富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)后第二代血小板濃縮制品。PRF主要是由血小板、白細(xì)胞和纖維蛋白基質(zhì)等共同構(gòu)成，其分子結(jié)構(gòu)類似于天然血凝塊，富含多種細(xì)胞因子。PRF可以借助生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行組織修復(fù)，具有誘導(dǎo)組織再生和促進(jìn)組織愈合的特性[2]。另外，PRF是一種不含體外抗凝物質(zhì)的完全自體血濃縮物，不但內(nèi)含大量生長(zhǎng)因子，且具有獲取途徑容易，制作過程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[3]。PRF目前已廣泛應(yīng)用于臨床，使用時(shí)主要制備成膜狀或凝膠狀。2014年，Choukroun團(tuán)隊(duì)通過改變離心速率制得注射型富血小板纖維蛋白(injectable platelet-rich fibrin，i-PRF)，通過利用非玻璃離心管在低速離心狀態(tài)下，降低纖維蛋白早期凝集，從而獲得i-PRF[4]。臨床使用時(shí)其制備方法更加簡(jiǎn)化，為一步離心，操作更加便捷，不需要膜狀或凝膠狀的剪切和擠壓塑性。i-PRF同傳統(tǒng)的PRF類似，但i-PRF富含更多的白細(xì)胞，以及能夠釋放更多的生長(zhǎng)因子[4]。本實(shí)驗(yàn)使用的是i-PRF，觀察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞骨架的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone 美國(guó))、胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司)、CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海生工有限公司)、羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton 美國(guó))、圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics美國(guó))、低速離心機(jī)(湖南恒心科技股份有限公司，型號(hào)：0TD3WS)。

1.2 方法

1.2.1兔成骨細(xì)胞的制備 2017年12月至2018年6月，選擇 出生一周的同胎新西蘭乳兔4只(20～25 g，西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供)。頸椎脫臼法處死后置于75%酒精中浸泡30 min，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取出顱頂骨，通過改良膠原酶和胰酶分段消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法獲取兔原代成骨細(xì)胞。通過堿性磷酸酶染色和茜紅素染色法進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定后取P3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2i-PRF的制備 新西蘭大白兔(2～2.5 kg 西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。無(wú)菌條件下，于每次兔子進(jìn)食后1 h后進(jìn)行動(dòng)脈血采集，一次性靜脈采血針配合i-PRF專用一次性真空采血管，每只兔子每次收集7 ml血液，立即置入TD3WS低速離心機(jī)(湖南恒心科技股份有限公司)中，設(shè)置i-PRF程序700 rpm/min，3 min，離心后可見血液分為2層：上層為i-PRF層，下層為紅細(xì)胞層。在超凈工作臺(tái)上，將每1 ml i-PRF加入5 ml α-MEM培養(yǎng)基，靜置3天后，1000 rmp條件下離心5 min，取上清液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾后即為i-PRF條件培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(i-PRF組)，對(duì)照組(α-MEM完全培養(yǎng)基 含10%FBS、2%雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)成骨細(xì)胞。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為1×105個(gè)/ml，取96孔板，表明時(shí)間節(jié)點(diǎn)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入50 μl上述細(xì)胞懸液，移入孵育箱2 h后取出，實(shí)驗(yàn)組每孔按4∶1的比例加入i-PRF條件培養(yǎng)基和α-MEM完全培養(yǎng)基共100 μl，空白組加入α-MEM完全培養(yǎng)基100 μl，每2～3天換液。分別培養(yǎng)1、3、5、7天后，吸出原培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗三次，向上述各孔加入CCK-8反應(yīng)液10 μl。按照CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀450 nm處進(jìn)行OD值檢測(cè)并記錄結(jié)果。

1.2.4堿性磷酸酶(ALP)染色 將細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種至24孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，移入孵育箱2 h后取出，實(shí)驗(yàn)組每孔按4∶1的比例加入i-PRF條件培養(yǎng)基和α-MEM完全培養(yǎng)基共100 μl，空白組加入α-MEM完全培養(yǎng)基100 μl，每2～3天換液。于細(xì)胞培養(yǎng)第5、7、9天，吸去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗三次，取細(xì)胞爬片進(jìn)行堿性磷酸酶檢測(cè)并通過Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.5細(xì)胞骨架形態(tài)觀察 將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的濃度置于6孔板中制作細(xì)胞爬片。每組每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于12、24、48 h后吸去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗三次，4%多聚甲醛溫室固定10 min，PBS清洗30 s，0.5%Triton X-100溶液完全覆蓋細(xì)胞，溫室處理5 min，PBS清洗30 s，滴加200 μl 10 nm的羅丹明-鬼筆環(huán)肽，室溫避光處理30 min，PBS清洗30 s，在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞骨架形態(tài)及細(xì)胞核觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，各組細(xì)胞培養(yǎng)的OD值總體比較及不同時(shí)點(diǎn)組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度值均顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞增殖結(jié)果OD值比較

2.2 兩組ALP染色結(jié)果比較隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，鏡下成骨細(xì)胞數(shù)目及表達(dá)藍(lán)染顆粒的細(xì)胞數(shù)目均增加，5、7、9天細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶藍(lán)染顆粒表達(dá)情況均表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1。2.3 i-PRF對(duì)細(xì)胞骨架形態(tài)的影響觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的增殖活性。成骨細(xì)胞培養(yǎng)的第12 h，空白組細(xì)胞呈現(xiàn)為較小的橢圓形，邊緣光滑整齊，無(wú)明顯的細(xì)胞突起，可見F-actin微絲蛋白環(huán)狀排列；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞開始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞三角形、長(zhǎng)梭形、多邊形等特點(diǎn)，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列。成骨細(xì)胞培養(yǎng)的第24 h，對(duì)照組細(xì)胞開始呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形樣伸展并可見胞漿突起，F(xiàn)-actin微絲蛋白開始沿細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞主要呈現(xiàn)為三角形、多邊形伸展，細(xì)胞伸展面積較對(duì)照組大，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細(xì)胞長(zhǎng)軸有規(guī)律的平行排列或交織成網(wǎng)狀。成骨細(xì)胞培養(yǎng)的第48 h，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)為多邊形伸展伴多個(gè)胞漿突起，伸展面積較前一時(shí)間節(jié)點(diǎn)明顯擴(kuò)大，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列或交織成網(wǎng)狀，排列相對(duì)紊亂；i-PRF組細(xì)胞呈現(xiàn)為三角形、多邊形及長(zhǎng)梭形伸展，伴豐富胞漿突起并相互連接，細(xì)胞伸展面積明顯較空白組大，F(xiàn)-actin微絲蛋白匯集成較粗的束狀，均勻、平行排列，規(guī)律性的沿細(xì)胞長(zhǎng)軸伸展。見圖2。

圖1 兩組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間ALP細(xì)胞染色結(jié)果比較 (×200) a：對(duì)照組5天；b：對(duì)照組7天；c：對(duì)照組9天；d：實(shí)驗(yàn)組5天；e：實(shí)驗(yàn)組7天；f：實(shí)驗(yàn)組9天

圖2 兩組細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)細(xì)胞骨架形態(tài)比較(熒光顯微鏡，×400) a：對(duì)照組12 h；b：對(duì)照組24 h；c：對(duì)照組48 h；d：實(shí)驗(yàn)組12 h；e：實(shí)驗(yàn)組24 h；f：實(shí)驗(yàn)組48 h

3 討論

大量研究[5，6]證明，PRF可以有助于傷口愈合，保護(hù)術(shù)區(qū)，促進(jìn)軟組織修復(fù)的作用，當(dāng)與骨移植材料混合時(shí)，可以促進(jìn)干細(xì)胞向移植中心遷徙，促進(jìn)新的血管形成。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)PRF不僅具有促進(jìn)新骨形成的作用，且可作為骨組織工程支架材料的選擇之一[7]。另外，有實(shí)驗(yàn)表明PRF可以單獨(dú)作為骨充填材料修復(fù)種植體周圍骨缺損，且修復(fù)的新骨與正常骨無(wú)明顯差異[8]。PRF中主要含有三種濃縮的細(xì)胞因子生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。PDGF在骨細(xì)胞的分裂和增殖的早期階段起著重要作用；TGF-β可以調(diào)節(jié)骨形成和吸收；VEGF是骨代謝的一種重要的局部調(diào)節(jié)因子，在一定劑量時(shí)則以發(fā)揮成骨的調(diào)節(jié)效應(yīng)，可以直接作用于成骨細(xì)胞。它們之間存在協(xié)同作用，加強(qiáng)各自的促進(jìn)作用[9]。i-PRF作為一種新型的不加入任何抗凝劑的可注射型富血小板纖維蛋白，通過低速離心(700 rmp，3 min) 即可制得[4]。有實(shí)驗(yàn)表明i-PRF較PRF能更好的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞遷徙，并釋放不同濃度的生長(zhǎng)因子的能力，更高的表達(dá)PDGF，TGF-β等[10]。Choukroun等[3]一項(xiàng)研究證明了降低離心力與生長(zhǎng)因子釋放之間的關(guān)系，離心過程產(chǎn)生的總細(xì)胞數(shù)量和生長(zhǎng)因子釋放水平在相同的血容量下只與特定的相關(guān)離心力暴露量有關(guān)。目前新的數(shù)據(jù)表明，白細(xì)胞和血小板的質(zhì)量、大小和密度范圍需要較低的相關(guān)離心力，這足以讓它們從血液中分離出來(lái)，且顯著增加白細(xì)胞、血小板數(shù)量，以及生長(zhǎng)因子濃度[11]。且有進(jìn)一步的研究顯示，i-PRF與骨移植材料混合時(shí)，可形成一移植骨塊，最大限度的減少骨移植顆粒的擴(kuò)散和遷移[12]。但有研究指出，過高濃度的生長(zhǎng)因子會(huì)抑制細(xì)胞的增殖分化[13]，本實(shí)驗(yàn)于無(wú)菌條件下，制取得到i-PRF條件培養(yǎng)液后稀釋至20%用于本實(shí)驗(yàn)，與Miron等[10]在實(shí)驗(yàn)中采用的i-PRF濃度一致。

本實(shí)驗(yàn)中，CCK-8結(jié)果顯示，隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，各組細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5、7 d的OD值兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的吸光度值均顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。此結(jié)果與董凱等[14]對(duì)富血小板纖維蛋白提取液(platelet-rich fibrin extrace，PRFe)對(duì)成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究中，細(xì)胞增殖情況結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn) ALP染色結(jié)果顯示隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，鏡下成骨細(xì)胞數(shù)目及表達(dá)藍(lán)染顆粒的細(xì)胞數(shù)目均增加，5、7、9 d細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶藍(lán)染顆粒表達(dá)情況均表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。其原因筆者認(rèn)為通過低速離心獲得的i-PRF富含多種生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞及血小板，對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性起著促進(jìn)作用，但本實(shí)驗(yàn)未對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性進(jìn)行定量檢測(cè)，這一假設(shè)仍需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn) i-PRF對(duì)細(xì)胞骨架形態(tài)的影響觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的增殖活性，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞骨架較對(duì)照組有更好的排列及伸展。初步分析其原因與i-PRF中釋放的多種生長(zhǎng)因子有密切關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)中未討論i-PRF的三維結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞的影響，仍須今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。i-PRF運(yùn)用時(shí)間較短，其生物性能有待進(jìn)一步研究，需要進(jìn)一步的相關(guān)臨床和實(shí)驗(yàn)研究以優(yōu)化臨床效益。

綜上所述，i-PRF能夠釋放一定濃度的生長(zhǎng)因子促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)細(xì)胞骨架的排列與伸展。這為臨床種植手術(shù)中的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。