趙 琳，張 妍，劉 穎，許崇晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

大豆是典型短日照作物，日照影響大豆開花時(shí)間及品質(zhì)等性狀。大豆生長發(fā)育過程多數(shù)對光周期反應(yīng)敏感，這一特點(diǎn)嚴(yán)重影響大豆品種跨區(qū)種植及適應(yīng)性。開花是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的重要過程，由植物內(nèi)部因素和外部環(huán)境共同調(diào)控。在各種環(huán)境因素中，光周期是決定大豆對日長季節(jié)變化適應(yīng)程度的主要因素之一[1]。

FT 基因是關(guān)鍵開花整合因子，具有高度保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，且編碼一類磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白[2]。FT 基因最初在擬南芥晚花突變體中被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T 蛋白通過與具有晝夜節(jié)律變化的卵磷脂結(jié)合促進(jìn)開花[3]。該基因在不同物種間具有高度保守性，隨分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，越來越多的FT 同源基因從不同植物中分離。目前在水稻中有2個(gè)FT同源基因，分別是調(diào)控短日照開花的Hd3a和調(diào)控長日照開花的RF-T1，當(dāng)Hd3a和RF-T1 分別在擬南芥和水稻中發(fā)生過表達(dá)時(shí)，均使植物花期提前[4-5]。洋蔥中共有6 個(gè)FT 同源基因，其中AcFT1 在適宜光周期條件下促進(jìn)植物組織鱗莖形成，AcFT2 促進(jìn)開花，而AcFT4 抑制植物組織鱗莖形成[6]。甜菜中包含BvFT1 和BvFT2 兩個(gè)FT 同源基因，在不發(fā)生春化作用條件下BvFT1 抑制BvFT2 表達(dá)進(jìn)而抑制開花，反之則抑制BvFT1表達(dá)，提高BvFT2表達(dá)促進(jìn)開花[7]。番茄中分別包含SlSP3D、SlSP5G、SlSP5G1、SlSP5G2、SlSP5G3 和SlSP6A 共6 個(gè)FT 同 源 基 因，其中SlSP3D 為番茄開花促進(jìn)因子，SlSP5G、SlSP5G2及SlSP5G3為番茄開花抑制因子[8]。大豆中有10 個(gè)FT 同源基因，分別為GmFT1a、GmFT1b、GmFT2a、GmFT2b、GmFT3a、GmFT3b、GmFT4、GmFT5a、GmFT5b 和GmFT6，其 中GmFT2a 和GmFT5a 為開花促進(jìn)因子，GmFT1a 和GmFT4 為開花抑制因子[9]。

大豆中不同F(xiàn)T 同源基因功能存在差異，在不同環(huán)境條件下，通過相互平衡方式影響開花和成熟時(shí)間。在大豆開花調(diào)控途徑中存在一種“蹺蹺板”模式的開花調(diào)控模型[10]，由于E1基因受日長調(diào)節(jié)，長日照促進(jìn)E1基因表達(dá)，在長日照條件下E1基因促進(jìn)開花抑制因子GmFT1a和GmFT4表達(dá)，同時(shí)E1 基因抑制開花促進(jìn)因子GmFT5a 和GmFT2a 表達(dá)，這時(shí)開花促進(jìn)效應(yīng)弱于開花抑制效應(yīng)，大豆表現(xiàn)晚花表型；短日照條件下則相反，短日照抑制E1 基因表達(dá)，促進(jìn)GmFT5a 和GmFT2a 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)大豆開花[11]。了解基因參與開花途徑與調(diào)控機(jī)理可提高大豆產(chǎn)量提供理論依據(jù)，而基因本身啟動子區(qū)域可能包含一些光周期響應(yīng)元件、參與晝夜節(jié)律元件及一些激素相應(yīng)元件等，這些元件調(diào)控基因表達(dá)?；騿幼友芯渴茄芯炕蚬δ艿囊环N方式。

目前，F(xiàn)T 基因表達(dá)調(diào)控方式主要以轉(zhuǎn)錄水平為主，啟動子是調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始不可缺少的工具之一。啟動子是基因5'端一段非編碼核苷酸序列，通過自身順時(shí)元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)量。啟動子區(qū)域上不同元件行使不同功能。未經(jīng)低溫處理的植物中，F(xiàn)LC與FT啟動子上的CArG box元件相互作用負(fù)調(diào)控FT表達(dá)。蘋果中MdF1基因在啟動子SUC2 驅(qū)動下，使擬南芥花期提前[12]。麻風(fēng)樹中JcFT在35s強(qiáng)啟動子作用下使擬南芥提早開花[13]。

李英華等為確定TCT-motif 在調(diào)節(jié)GmGBP1 表達(dá)中的重要性，選擇分析長短日照條件下GmGBP1啟動子中不同TCT-motif 瞬時(shí)表達(dá)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)短日照條件下誘導(dǎo)GmGBP1 啟動子中TCT-motif（SNP-796G）表達(dá)，推斷GmGBP1 啟動子受日長調(diào)節(jié)，而GmGBP1啟動子中TCT-motif（SNP-796G）以日長調(diào)節(jié)的表達(dá)模式發(fā)揮光響應(yīng)元件作用[14]。Liu等分析E1 基因是否影響GmFT1a 表達(dá)，通過構(gòu)建pGreen Ⅱ-0800-GmFT1a pro-LUC 表 達(dá) 載 體，初步證明E1 基因存在條件下，GmFT1a 啟動子表達(dá)活性增強(qiáng)[11]。通過研究基因啟動子活性，初步證明啟動子表達(dá)活性是否受相應(yīng)條件的影響。

在大豆中，Jiang等通過測序GmFT2a基因啟動子區(qū)域及其編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)GmFT2a編碼區(qū)在不同品種間具有高度保守性，GmFT2a啟動子區(qū)域具有豐富多態(tài)性[15]。啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上重要調(diào)控元件，決定基因在特定條件下的表達(dá)。關(guān)于GmFT2a啟動子研究已有報(bào)道，另一個(gè)大豆開花促進(jìn)因子即GmFT5a基因啟動子研究目前尚未見報(bào)道。Cai等發(fā)現(xiàn)在調(diào)控開花途徑中GmFT5a作用與日長有關(guān)[16]。因此為進(jìn)一步確定GmFT5a 基因是否受日長調(diào)控，本文采用農(nóng)桿菌滲透介導(dǎo)的體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)方法分析長短日照對GmFT5a基因啟動子活性的影響，進(jìn)一步探討日長對GmFT5a 基因的影響。推斷GmFT5a基因可能通過啟動子上光響應(yīng)元件的調(diào)控參與調(diào)控光周期。

1 材料與方法

1.1 材料

農(nóng)桿菌菌株EH105、P19由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；pGreenⅡ0800載體由山東大學(xué)向鳳寧教授提供：大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自TaKaRa公司。Plasmid Mini Kit試劑盒、Gel&PCR Clean Up Kit 試 劑 盒 均 購 自O(shè)MEGA 公 司；In-Fusion?HD Cloing Kit 試 劑 盒、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、SmaⅠ限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa 公司；雙螢光素酶報(bào)告基因（LUC）檢測試劑盒購自Promega公司。PCR引物合成及DNA測序工作均由北京華大基因科技有限公司完成。

1.2 proGmFT5a::LUC融合表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Phytozome上proGmFT5a序列設(shè)計(jì)引物（見表1），以東農(nóng)42 為模板，利用GmFT5a P-F 和GmFT5a P-R 引物作PCR，擴(kuò) 增proGmFT5a 片 段（1 167 bp），并將擴(kuò)增產(chǎn)物純化。提取pGreenII 0800載體質(zhì)粒，用Sma I 限制性內(nèi)切酶單酶切，將酶切產(chǎn)物膠回收，通過In-Fusion 無縫連接將pro-GmFT5a片段重組到pGreenII 0800載體上，獲得重組質(zhì)粒。

利用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan 抗性LB 固體培養(yǎng)基中篩選，挑取單斑，PCR鑒定陽性克隆，測序，將測序正確的結(jié)果提取質(zhì)粒，利用測序正確的proGmFT5a::LUC質(zhì)粒與pSoup質(zhì)粒同比例混合，采用電擊轉(zhuǎn)化方式共同轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，在含有抗生素50 mg·L-1Kan，25 mg·L-1Rif 和100 mg·L-1Spec 固體YEP 培養(yǎng)基上篩選，挑取單斑PCR 鑒定。將陽性重組農(nóng)桿菌與30%甘油以1：1比例混合存放于-80 ℃冰箱，用于注射煙草。

表1 proGmFT5a擴(kuò)增引物序列Table 1 Primers sequences for GmFT5a promoter amplification

1.3 煙草中瞬時(shí)表達(dá)分析

按照2：1：1比例將花卉營養(yǎng)土、蛭石、沙土混合均勻，并用水全部浸濕。浸濕后將禾本氏煙草種子用移液槍點(diǎn)播到混合均勻的基質(zhì)中。選擇20 d 左右生長狀態(tài)良好煙草葉片用于農(nóng)桿菌侵染。將重組農(nóng)桿菌和含有P19的農(nóng)桿菌分別活化一次，并用懸濁液將菌液重懸直至OD600=1，按照1：1 比例將重組農(nóng)桿菌和含有P19的農(nóng)桿菌混合均勻，室溫靜置4 h后注射煙草。對注射菌液的煙草長短日照處理（長日照為16 h光照，8 h黑暗，短日照為16 h黑暗，8 h光照），培養(yǎng)48 h后取樣，3次重復(fù)。取樣材料以海腎螢光素酶為內(nèi)參，螢火蟲螢光素酶測定得到的RLU值除以海腎螢光素酶測定得到的RLU值，根據(jù)比值比較經(jīng)長短日照處理后不同時(shí)間點(diǎn)GmFT5a啟動子激活程度。

1.4 GmFT5a啟動子生物信息學(xué)分析

利用PLANTCARE 對GmFT5a啟動子序列作順式元件分析和功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 proGmFT5a::LUC融合表達(dá)載體構(gòu)建

為驗(yàn)證GmFT5a受日長表達(dá)影響的情況，本文通過啟動子開展研究。首先利用GmFT5a P-F 和GmFT5a P-R引物，以大豆品種東農(nóng)42為模板擴(kuò)增出GmFT5a 基因啟動子片段，片段長度為1 167 bp（見圖1）。然后選擇SmaⅠ限制性內(nèi)切酶單酶切方式將環(huán)狀pGreenII 0800單酶切切成線性的pGreenII 0800，并用Infusion 連接方式將GmFT5a 基因啟動子連接至pGreenII 0800 載體（見圖2）。采用熱激法將構(gòu)建的proGmFT5a::LUC載體轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Kan抗性培養(yǎng)基中篩選，并PCR鑒定獲得proGmFT5a::LUC- pGreenII 0800 陽性菌株（見圖3）。將測序正確的陽性菌株提取質(zhì)粒，與pSoup質(zhì)粒同比例混合，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中，在含抗生素50 mg·L-1Kan、25 mg·L-1Rif 和100 mg·L-1Spec 固體培養(yǎng)基中篩選，并通過PCR鑒定獲得陽性菌株（見圖4）。

2.2 proGmFT5a::LUC在煙草中瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果

選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)的方法，將proGmFT5a::LUC菌液注射到本氏煙草中，經(jīng)長短日照處理48 h后，分別在開燈后4 h和12 h取材。分別分析經(jīng)長短日照處理后4 h和12 h取材的GmFT5a啟動子表達(dá)活性。結(jié)果如圖5、6所示，開燈后4 h與12 h取材結(jié)果一致，均為短日照條件下GmFT5a表達(dá)活性高于長日照條件下GmFT5a表達(dá)活性?？梢姸倘照照T導(dǎo)GmFT5a啟動子表達(dá)，GmFT5a受短日照誘導(dǎo)，進(jìn)一步說明GmFT5a為光周期調(diào)控因子。

2.3 GmFT5a啟動子生物信息學(xué)分析

利用在線軟件PLANTCARE 分析GmFT5a 啟動子序列，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmFT5a 啟動子存在5 個(gè)與光響應(yīng)有關(guān)順式元件，分別為BOX 4、G-box、GT1-motif、Gap-box和chs-CMA1a，具體位置及功能如表2 和圖7 所示。由此可以推斷GmFT5a 參與光周期調(diào)控可能通過上述5個(gè)與光響應(yīng)有關(guān)的順式元件實(shí)現(xiàn)。

表2 GmFT5a啟動子中光響應(yīng)順式調(diào)控元件位置與推測功能Table 2 Position and speculative function of light-responsive cis-regulatory element in GmFT5a promoter

3 討論與結(jié)論

大豆對光周期響應(yīng)敏感，其在短日照條件下提早開花，長日照條件下延遲開花。雖然大豆適應(yīng)性廣泛，但其個(gè)體品種緯度適應(yīng)性相對狹窄。適應(yīng)南方短日照的大豆品種在北方長日照條件下種植，花期往往延遲甚至不開花。適應(yīng)北方長日照的大豆品種在南方短日照條件下種植，花期提前，產(chǎn)量減少。由此說明，調(diào)節(jié)開花途徑可增加大豆產(chǎn)量。

目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控大豆生育期基因有E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10 和J，其中決定光周期敏感性的基因主要是E1、E3、E4 和E7。E1是大豆特有的調(diào)控開花基因，抑制GmFT2a和GmFT5a 表達(dá)，且受日長調(diào)控，短日照抑制E1表達(dá)。E2基因是擬南芥GI同源基因。E2基因主要通過調(diào)控GmFT2a 而非GmFT2a 調(diào)控開花時(shí)間。E3和E4基因是光敏色素光受體，分別為GmPHYA3和GmPHYA2。E3 在紅光與遠(yuǎn)紅光量子比較高的長日照條件下調(diào)控開花，而E4 是在紅光與遠(yuǎn)紅光量子比較低長日照的條件下調(diào)控開花。E3和E4基因在光周期調(diào)控系統(tǒng)中，GmFT2a 和GmFT5a 在短日照條件下可重復(fù)強(qiáng)烈誘導(dǎo)開花，在長日照條件下抑制GmFT5a 和GmFT2a 表達(dá)，延長開花時(shí)間。綜上所述，這些調(diào)控結(jié)果均表明，大豆光周期調(diào)控開花途徑在GmFT5a 和GmFT2a 處匯合。因此研究GmFT5a和GmFT2a調(diào)控開花途徑具有重要意義。

大豆GmFT5a 和GmFT2a 是開花調(diào)控過程中的整合因子。Nan 等發(fā)現(xiàn)GmFT5a 和GmFT2a 過表達(dá)時(shí)，大豆Williams 82 在長日照條件下提早開花[17]。Schwartz等發(fā)現(xiàn)擬南芥中FT啟動子序列發(fā)生不同的自然變異，導(dǎo)致開花時(shí)間不同[18]。Kong 等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，開花相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控FT的cis元件表達(dá)[9]。不同植物FT基因在擬南芥中異位表達(dá)，調(diào)控自身開花途徑。龍眼FT1a在擬南芥中異位表達(dá)時(shí)促進(jìn)植物開花，與其相反的是DIFT2在擬南芥中發(fā)生異位表達(dá)時(shí)則抑制開花[19]。在甘蔗中，ScFT1 在擬南芥中異位表達(dá)開花[20]。GmFT2a 和GmFT5a 在擬南芥中異位表達(dá)也促進(jìn)擬南芥提早開花。

Cai等研究證明GmFT5a和GmFT2a共同調(diào)節(jié)大豆花期，長日照條件下GmFT5a 效應(yīng)比GmFT2a 更顯著，而短日照條件下，GmFT2a 效應(yīng)比GmFT5a更顯著，說明GmFT5a是大豆適應(yīng)高緯度地區(qū)的關(guān)鍵[16]。目前關(guān)于GmFT5a 在長短日照條件下誘導(dǎo)大豆開花的個(gè)體效應(yīng)及其對下游開花相關(guān)基因的差異調(diào)控信息十分有限。因此為確定GmFT5a參與大豆開花途徑的調(diào)控是否受日長影響，本文通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法研究GmFT5a基因，該方法具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。通過克隆GmFT5a基因啟動子片段，將GmFT5a基因啟動子與LUC基因融合構(gòu)建融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，將注射菌液的煙草分別作長短日照處理，進(jìn)而分析GmFT5a啟動子瞬時(shí)表達(dá)活性，結(jié)果表明無論是日照條件長短，GmFT5a啟動子均驅(qū)動LUC基因優(yōu)勢表達(dá)。經(jīng)長短日照處理后4 h與12 h 取材得到結(jié)果一致，均為在短日照條件下GmFT5a啟動子表達(dá)活性高于長日照條件下GmFT5a啟動子表達(dá)活性。由此推斷短日照誘導(dǎo)GmFT5a基因啟動子表達(dá)，GmFT5a受日長調(diào)節(jié)。進(jìn)一步確定GmFT5a 是光周期調(diào)控因子，并通過PLANTCARE 啟動子在線預(yù)測分析工具分析GmFT5a 基因啟動子上存在5 種光響應(yīng)元件，可初步推斷GmFT5a 可能通過啟動子順式元件調(diào)控光周期。

通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法初步判斷短日照誘導(dǎo)GmFT5a 啟動子表達(dá)，但具體是GmFT5a 啟動子區(qū)域哪個(gè)元件響應(yīng)短日照，GmFT5a啟動子是否具有多態(tài)性，需進(jìn)一步研究，本文僅初步證明GmFT5a啟動子被短日照誘導(dǎo)，啟動子上含有光響應(yīng)元件，再一次證明GmFT5a是光周期調(diào)節(jié)因子。GmFT5a是短日照作物大豆適應(yīng)長日照環(huán)境的關(guān)鍵基因，研究為提高不同品種大豆產(chǎn)量提供理論依據(jù)。