齊 明，何貴平，王海蓉，邱勇斌，程亞平，徐肇友

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；2.浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌 323300；3.浙江省開化縣林場，浙江 開化 324300；4.浙江省慶元縣慶元林場，浙江 慶元 323805；5.浙江省龍泉市林科院，浙江 龍泉 323700 )

林木施肥是人們有意識地將有機(jī)或無機(jī)的營養(yǎng)物質(zhì)施入土壤中或噴施在植物體上，改變植物生長的外部營養(yǎng)環(huán)境，以改善林木營養(yǎng)狀況，促進(jìn)林木生長。Beautils[33]提出了配方施肥和平衡施肥的理論，已在林業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，目前國內(nèi)外主要用材樹種的人工林普遍進(jìn)行了施肥技術(shù)研究[1-2]。各國對不同肥料類型、不同養(yǎng)分配比、不同立地條件、不同培育階段的林地施肥措施進(jìn)行了深入研究[1,3-6]，取得了許多成果，并廣泛應(yīng)用于林業(yè)生產(chǎn)。杉木Cunninghamia lanceolata對地力要求較高，目前我國杉木存在連栽和杉木造林地肥力不高等問題，采用營養(yǎng)遺傳理論選育氮磷高效利用的無性系是解決問題的一個辦法，但既對磷高效利用又對氮高效利用的杉木少而又少，所以施肥必需的。林業(yè)上有關(guān)杉木施肥進(jìn)行了廣泛的試驗研究，但是施肥引發(fā)的基因響應(yīng)分子機(jī)制卻了解很少。本研究的目的是運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究杉木施肥的基因響應(yīng)機(jī)制，可為杉木的施肥診斷和施肥方案的制定提供科學(xué)依據(jù)，為杉木營養(yǎng)遺傳育種展開MAS 選擇提供重要參考。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，對植物營養(yǎng)脅迫條件下磷的運(yùn)轉(zhuǎn)已有研究：如Li 等[7]采用水培法，進(jìn)行磷脅迫處理，研究了PHT基因在杉木根莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律；Lu 等[8]運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究了小麥Triticum aestivum施用有機(jī)肥和無機(jī)肥后，差異基因表達(dá)的規(guī)律；桑健[9]采用水培脅迫法，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘出與超積累型東南景天Sedum alfredii，HE的重金屬耐受性及超積累性相關(guān)的脅迫應(yīng)答基因：6個潛在的重金屬的應(yīng)答基因；陳雙雙[10]以超積累型東南景天為研究材料，采用水培脅迫的方法，研究了SaHsf家族基因?qū)帷⒗?、干旱、鹽、外源激素ABA和重金屬Cd 處理的應(yīng)答機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與0 h 處理相比，12 h的脅迫處理就可以誘導(dǎo)抗逆顯著的上調(diào)表達(dá)基因，和表達(dá)顯著受抑制的下調(diào)基因。同時揭示了在Cd的脅迫下，SaHsf基因在根、莖、葉中均存在3種類似的表達(dá)模式；張運(yùn)興[11]以旱柳的栽培變型饅頭柳Salix matsudanaf.umbraculifera為研究對象，旱柳Salix matsudana.為對照，探索二者在鎘脅迫后的形態(tài)、生理生化和分子方面的差異，隨后通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從分子層面挖掘鎘吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒等相關(guān)基因，進(jìn)而解析分子調(diào)控機(jī)制；Geng 等[12]運(yùn)用水培進(jìn)行磷脅迫的方法，研究了水稻Oryza sativa中磷的吸收與運(yùn)轉(zhuǎn)；Loth-perereda 等[13]運(yùn)用水培進(jìn)行磷脅迫的方法，研究了PHT1基因家簇在楊樹Populus tremula中，結(jié)構(gòu)與表達(dá)譜的變化。在杉木中借助RNA-seq 技術(shù)，研究杉木纖維性狀發(fā)育的形成機(jī)制和木材形層成活動的規(guī)律，也有些研究[14-18]。但杉木施肥響應(yīng)基因研究，目前尚未被涉及，施肥造成杉木高生產(chǎn)力的分子機(jī)制也未知，這是本研究要解決的關(guān)鍵問題。

本研究以基因差異表達(dá)分析為切入點，以杉木無性系開6為研究材料，4個施肥處理，兩兩間的比較分析，來探討杉木施肥刺激引起的分子響應(yīng)機(jī)制，揭示杉木施肥高生產(chǎn)力的原因。開展本項研究，以期了解施肥引發(fā)的基因響應(yīng)機(jī)制，為研究與印證差異表達(dá)基因的功能提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 研究材料與研究方法

1.1 研究材料

研究材料為速生的杉木無性系開6，2017年春進(jìn)行扦插，年底抽取苗高基本一致，約25 cm 高的開6 共計12株，參與試驗。

1.2 試驗設(shè)計

移植苗放在試驗大棚內(nèi)，采用容器杯培苗，容器規(guī)格為直徑14 cm、高13 cm。培苗基質(zhì)為杭州市三橋育苗基地的缺氮少磷紅壤土，其中缺氮少磷紅壤土含有機(jī)質(zhì)20.28 g.kg-1，全氮、全鉀和全磷含量分別為0.427 g·kg-1、11.20 g·kg-1和0.269 g·kg-1，水解氮、有效鉀和有效磷含量分別為39.3 mg·kg-1、131.60 mg·kg-1和2.44 mg·kg-1，pH 值4.55。

培苗基質(zhì)的配制[19]如下：缺素紅壤土∶河沙，按3:2的比例，混均勻后裝杯，每杯土重2 kg，種一株杉木無性系開6，然后移到育苗大棚中緩苗6個月，其間不施肥，僅正常水分管理。到了2018年6月初，開始施肥試驗，施肥量參照杉木育苗的施肥標(biāo)準(zhǔn)，試驗設(shè)計如下表1。

表1 杉木施肥試驗設(shè)計(硝酸銨和磷酸二氫鉀溶于水的濃度為7‰)?Table1 Test design of fertilization for Chinese fir

杉木施肥試驗設(shè)計的宗旨是檢驗施肥引發(fā)的基因響應(yīng)，整個試驗以缺磷少氮的貧瘠土為基質(zhì)，施肥處理為：不施肥的貧瘠土地，對貧瘠林地單施氮肥或磷肥，以同時施加N、P 肥為參比對象。試驗植株的編號是：group1 缺素組，三個重復(fù)分株編號碼：C1-1，C1-2，C1-3；group2 施氮肥組，三個重復(fù)分株編號：N1-1，N1-2，N1-3；group3施磷肥組，三個重復(fù)分株編號：P1-1，P1-2，P1-3；group4 同施氮磷肥，為試驗對照組WT，三個重復(fù)分株編號：WT1-1，WT1-2，WT1-3。選擇連續(xù)幾天天晴的天氣，開始施肥試驗，水肥150 ml 分三次澆肥，每隔12 h 澆50 ml的水肥，最后一次施肥后80 h后（12:00）進(jìn)行取樣：用自來水將杉木的根系洗盡，又用純凈水沖洗一遍，用剪刀將當(dāng)年生的新根剪下，用鋁箔紙包好，迅速浸泡在液氮中，第二天轉(zhuǎn)移至-80℃的冰箱中，直至提取RNA時才放到冰塊上。

1.3 研究方法

1.3.1 cDNA 文庫準(zhǔn)備及RNA-seq 測序

文庫構(gòu)建、無參轉(zhuǎn)錄組測序、及隨后的unigene 功能注釋、基因表達(dá)分析等項目的分析見有關(guān)文獻(xiàn)[20-24]。

1.3.2 序列比對及差異表達(dá)基因分析

通過Illumina Hiseq4000 測序獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過以下幾個步驟的生物信息學(xué)處理與分析[18,20-24]，方能獲得有意義的結(jié)果：1）原始數(shù)據(jù)處理；2）序列組裝；3）unigene 序列的功能注釋；4）unigene的GO 分類；5）unigene 代謝通路分析；6）預(yù)測unigene的編碼序列（CDS）；7）unigene的表達(dá)差異分析；8）差異表達(dá)的unigene的GO和Pathway 富集分析。所有這些分析項目均由軟件完成，除了杉木新根樣本的準(zhǔn)備和研究方案的制定外，整個項目中的測序和初步分析委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

unigene 歸一化采用FPKM(Fragments per kb per Million fragments)方式，其計算公式：

式（1）中：FPKM是某個基因(A)的表達(dá)量，C是唯一比對到基因A的片段數(shù)，N是唯一比對到所有unigene的總片段數(shù)，L為unigene A的堿基數(shù)。

測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步在Excel 平臺和MatLab7.0 平臺上處理，以獲得有用的信息[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量和基因表達(dá)概況

不施肥處理、氮肥處理、磷肥處理和對照（氮磷混施）處理，共12個樣本，測序測得的原始序列（Raw Reads）介于5.1E+07到7.2E+07 nt；12個樣本的Clean reads 分別介于5.0E+07到7.1E+ 07 nt。總的拼接長度724,341,090 nt。Clean reads有效數(shù)據(jù)占原始Raw Reads的比例在98%以上。12個樣本的Phred 數(shù)值大于Q20和Q30的堿基占總體堿基的百分比，分別介于98.20%～98.84%和95.07%～96.4%。原始測序序列中，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)的百分比介于44.20%～45.08%之間。

12株樣本，測得的基因表達(dá)量在不同區(qū)間的分布接近正態(tài)分布。綜合以上幾個測序質(zhì)量評價指標(biāo)，說明12 份樣本的測序質(zhì)量較高，能保證后續(xù)研究和滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求。

2.2 測序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果

測序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果列于表2。

從表2可見，平均GC%達(dá)42.47%；當(dāng)讀長數(shù)達(dá)50%時，該讀長的長度為1 463 nt。綜合其它項的結(jié)果,可以得出測序數(shù)據(jù)的組裝拼接的結(jié)果很成功。杉木新根測序獲得的unigene為74 288，這一結(jié)果與杉木針葉測序獲得的結(jié)果[26]（80 171個unigenes）十分接近，測序結(jié)果正常。

2.3 基因注釋結(jié)果

對clean reads 在6個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX 分析，比對結(jié)果列于表3。

表2 拼接結(jié)果的統(tǒng)計Table2 Statistics of splicing results

表3 不同數(shù)據(jù)庫BLASTX 注釋結(jié)果統(tǒng)計Table3 Statistics of BLAST annotation of different database

將獲得的unigene 序列分別與Swiss-prot,Nr,Pfam,KEGG,eggNOG和GO數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，獲得注釋,組裝unigene 數(shù)為74288個注釋基因。由于針葉樹已進(jìn)行全基因組測序的樹種太少，因而與農(nóng)作物相比，針葉樹種中挖掘出的基因也少。為了獲得良好的測序分析結(jié)果，今后要加快針葉樹的全基因組的測序研究。

2.4 不同的試驗處理組間的基因差異表達(dá)模式分析

基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，繪制基因差異表達(dá)韋恩圖（圖1）。

圖1 杉木不同施肥處理引起基因響應(yīng)之韋恩圖Fig.1 A Venn diagram of different fertilizer treatments induced gene response

由韋恩圖可以發(fā)現(xiàn)基因差異表達(dá)模式：不同的調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)（Transcriptional networks）在無性系中會重新結(jié)合，并導(dǎo)致基因表達(dá)方式的改變。

從圖1（左）可見，在-P-N1-VS-WT 比較組中，它們有64 673個共同基因，相對于WT 比較組，未施肥組，有4 650個特異表達(dá)基因，其中包含了若干耐性基因；在N-P-VS-WT 比較組中，有63 888個共同基因，有6 708個特異表達(dá)基因，其中包含了若干磷素的敏感基因；從圖1（右）可見，在P-N-VS-WT 比較組中，它們有61 626個共同基因，施P 肥后，樣株受P 肥刺激，引起了7 227個特異表達(dá)基因,其中包含了若干氮素的敏感基因表達(dá)；N-P_VS_P-N 比較組的韋恩圖未列出，N-P 處理與P-N 處理有共同基因65 768個，N-P 處理引發(fā)了4 828個特異表達(dá)基因的表達(dá)，P-N 處理引發(fā)了3 085個特異表達(dá)基因的表達(dá)。這些差異表達(dá)的基因參與了杉木氮磷的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。

2.5 4個不同施肥處理6個處理比較組的差異基因表達(dá)分析

4個不同施肥處理6個處理比較組的差異基因表達(dá)分析結(jié)果列于表4。

表4 杉木轉(zhuǎn)錄組組內(nèi)差異基因表達(dá)分析結(jié)果Table4 Differentially expressed genes in different groups

由表4可知，不同的比較組間，差異表達(dá)顯著和不顯著的基因數(shù)目是不同的，施肥可以引起一些基因上調(diào)表達(dá)，或下調(diào)表達(dá)；也能引起一些基因默；同一比較組內(nèi)，顯著表達(dá)基因中，上調(diào)基因數(shù)與下調(diào)基因不等，表達(dá)不顯著中，上調(diào)基因數(shù)與下調(diào)基因數(shù)也不等；各施肥處理組引起沉默的基因數(shù)在3 694～21 291 間變動。

2.6 杉木基因表達(dá)量的熱聚類分析與施肥的分子響應(yīng)

從測序組裝、比對注釋和基因表達(dá)量計算到基因的富集分析，最終從各樣本組獲得的差異表達(dá)基因中，分別抽取表達(dá)量極其顯著25 左右個基因，進(jìn)行熱聚類圖分析。熱聚類圖一共做了六組，這六組的熱聚類結(jié)果是一致的：比較組內(nèi)有一組是對照組，如表達(dá)顯著的差異基因在對照組中高表達(dá)，則在試驗組就低表達(dá)，它們是互補(bǔ)關(guān)系。在此僅列出一個比較組（施氮肥與不施肥組）的熱聚類分析結(jié)果圖，來說明這一結(jié)果。在圖2中，不同顏色的區(qū)域代表不同的基因表達(dá)信息，同一處理內(nèi)三個生物學(xué)重復(fù)間基因表達(dá)基本上是一致，而同一比較組中不同處理間，基因表達(dá)基本上是互補(bǔ)的：基因甲在處理組高表達(dá)，則在對照組就低表達(dá)，反之亦然。例DN56564_c1_g4 在未施肥處理組是低表達(dá)，則在施氮組中是高表達(dá)。如果在杉木林中檢測到DN56564_c1_g4、DN56906_C1_g1、DN54750_c1_g2_、DN55368_c2_g1、DN54759_c1_g6、DN61447_c0_g4、DN62531_c0_g9、DN62712_c0_g1、DN32638_C0_g2 這9個基因下調(diào)表達(dá)的話，那么意味著該林分該施氮肥了。通過對這9個基因的功能進(jìn)行了追蹤發(fā)現(xiàn)：這9個基因多與氨基酸、蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能有關(guān)。

圖2 N1_VS_C1 比較組間熱聚類Fig.2 group2_VS_group1_heatmap

圖2不同區(qū)域的基因表達(dá)模式相近,同一處理內(nèi)基因分為上調(diào)表達(dá)和下調(diào)低表達(dá)，同一比較組內(nèi)不同處理間，相同基因的表達(dá)是上調(diào)表達(dá)與下調(diào)表達(dá)互補(bǔ)，其它比較組的結(jié)果與圖2一致，只是上調(diào)、下調(diào)的基因變了。這一結(jié)果說明，在缺素（缺N、P）造林地上，進(jìn)行杉木施肥時，應(yīng)該多肥種進(jìn)行混合施肥；而且從施肥誘導(dǎo)的表達(dá)基因數(shù)量上看，磷肥的施肥量可以與氮肥可以不等量，這一結(jié)果與林業(yè)生產(chǎn)實踐中得到了印證：在杉木經(jīng)營中，施鈣鎂磷肥的施用量通常是尿素的三倍左右[27-30]，這是由于鈣鎂磷肥易被固定，其利用率僅為10%～20%的緣故。林業(yè)施肥中，不同類肥料的吸收有相互促進(jìn)的現(xiàn)象。但從所有的熱聚類圖還不能肯定或否定不同的肥種間對氮肥或磷肥的吸收利用,有相互促進(jìn)作用的結(jié)果。

2.7 差異表達(dá)基因的GO 富集和分類分析

GO（gene ontology）是基因本體聯(lián)合會（Gene Onotology Consortium）所建立的數(shù)據(jù)庫,用于描述基因產(chǎn)物的功能。為全面了解施肥對基因差異表達(dá)的影響，以對照的基因為參照物，對六個比較組間的差異基因做了成對分析，獲得了六個比較圖表。差異表達(dá)基因的入選標(biāo)準(zhǔn)：1）Abs[ log2fold_change]＞1；2）經(jīng)FDR的校正過的P value ＜0.05。本研究選取C1-VS-WT 比較組，對所有的DEGs 進(jìn)行GO 功能富集分析作圖,進(jìn)行示范：GO 富集和分類分析作圖時，GO 功能分類體系中，有參與生物過程biological process、細(xì)胞組分Cell components 以及分子功能Molecular function 三個大類，50個小類別。不施肥與對照比較組的基因富集與分類結(jié)果見圖3。

由圖3可見，以對照組WT為參照物，在不施肥處理C1 中，不同的GO terms 中，參與新陳代謝的基因數(shù)目不同；針對大多數(shù)GO terms，上調(diào)基因的稍稍超過了下調(diào)基因的趨勢；下調(diào)極顯著的三個GO terms，按基因數(shù)目多少的排序（下同）是：等離子體的膜＞細(xì)胞核＞膜的有機(jī)組成。上調(diào)極顯著的三個GO terms是細(xì)胞核＞細(xì)胞質(zhì)＞分子功能；所有GO terms 上，存在顯著的上調(diào)、下調(diào)基因，且上調(diào)基因略占優(yōu)勢。按照以上思路，其它比較組GO 富集與分類分析的一般結(jié)果列于表5。

圖3 C1_VS_WT 比較組差異表達(dá)基因的GO 富集與分類（up：上調(diào)基因；down：下調(diào)基因）Fig.3 GO classification of differentially expressed genes in group1-vs-group4

由表5可見，不施肥處理、施肥處理六個比較組，對杉木GO terms 影響最大的，定位在葉綠體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)上；其次是分子功能、蛋白質(zhì)結(jié)合和生物過程等。從GO的富集與分類結(jié)果可以得出結(jié)論：施氮肥可以促進(jìn)磷的吸收和代謝，同時施磷肥也可以促進(jìn)氮的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)，因為氮和磷是生命元素，細(xì)胞分裂、伸長和發(fā)育都需要氮和磷，細(xì)胞活動是杉木生長發(fā)育的基礎(chǔ)。缺乏氮素磷素山地上的杉木，表達(dá)較多的基因是對貧瘠的耐性基因。施肥后杉木林地的土壤環(huán)境發(fā)生了變化，對杉木根系產(chǎn)生刺激，誘導(dǎo)新的基因表達(dá)或上調(diào)一些差異基因表達(dá)，耐性基因可能下調(diào)或沉默了，新的基因又影響杉木體內(nèi)的生理生化代謝途徑的改變，這些正調(diào)控和負(fù)調(diào)控相互影響，從而推動了杉木整體的生長發(fā)育。

以前通常認(rèn)為：上調(diào)基因的表達(dá)對植物生長發(fā)育具有正向效應(yīng)；顯著下調(diào)的差異基因可能對植物產(chǎn)生負(fù)向效應(yīng)。但這里的研究表明，杉木施肥試驗中，并不能肯定所有的基因表達(dá)增強(qiáng)就是有利的,并不能肯定所有的基因下調(diào)就是不利，如果不是這樣的話，下調(diào)基因數(shù)超過上調(diào)基因數(shù)（表5中P1-VS-C1；P1-VS-N1）時，杉木樣株怎么能生存?所以某些基因受到抑制也是有利的，這與姜濤等[31]的研究結(jié)果一致。

2.8 施肥對杉木的生理生化過程影響進(jìn)一步分析

氮磷是生命元素。由上述分析可見，施氮肥或磷肥可以促進(jìn)杉木的生長發(fā)育。但杉木的生長發(fā)育是由一系列的生理生化過程來完成。其中蛋白質(zhì)在細(xì)胞分裂、生長伸長等生理過程發(fā)揮重要作用，但是蛋白質(zhì)的合成過程是細(xì)胞核中的DNA模板上的mRNA，擴(kuò)散到核外，在核蛋白體上形成一個合成蛋白質(zhì)的模板。這時，較小的tRNA 復(fù)合體向mRNA模板靠攏，找到一個正確的“位點”。mRNA 能辨認(rèn)tRNA 上與之相符的反密碼子。這樣tRNA 正確地將不同的氨基酸一個一個地帶到mRNA的相應(yīng)位置上，最后靠肽鍵將氨基酸連接起來，形成多肽鏈，并釋放出tRNA。多肽折疊就是蛋白質(zhì)，在這一過程中氨基酸—tRNA 大分子化合物的合成，成為合成蛋白質(zhì)的重要一環(huán)。

由于蛋白質(zhì)合成的重要性，我們選擇施磷肥處理與對照組來分析施肥對杉木的生理生化過程的影響。根據(jù)KEGG 富集，得到tRNA 大分子化合物的合成途徑：氨?；猼RNA 生物合途徑，見圖4。其中，天門冬氨酰—tRNA合成酶[EC:6.1.1.12]顯著上調(diào)，而其它的合成酶或轉(zhuǎn)移酶不顯著表達(dá)。在圖4中，tRNA 在一系列的酶基因的催化作用下，分別與L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-天門冬氨酸，形成氨基酸-tRNA 大分子化合物，為下一步蛋白質(zhì)的合成，提供前體（多肽）。這些催化酶基因見圖4，其中天門冬氨?！猼RNA 合成酶[EC:6.1.1.12]顯著上調(diào)，催化L-天門冬氨酸與tRNA，形成L-天門冬氨酰-tRNA，并使得這一反應(yīng)過程在7 條通道中占主導(dǎo)地位。施磷肥促進(jìn)了天門冬氨?！猼RNA 合成酶[EC:6.1.1.12]上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)L-天門冬氨酰-tRNA 大分子化合體的形成，也促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成。另外值得說明的是丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝在施磷組中得到顯著富集，這為氨?；猼RNA 生物合成，提供了充足的前體。

表5 顯著差異表達(dá)基因GO 富集與分類前三名分析結(jié)果 Table5 Significant differences in expression gene GO enrichment and classification of the first three results

圖4 氨酰基—tRNA 生物合成途徑Fig.4 Aminoacyl—tRNA Biosynthesis

3 結(jié)論與討論

水培法研究營養(yǎng)元素的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律，結(jié)果中包含了元素間的互作。但是砂培法也是有其局限性的：砂培的培養(yǎng)基質(zhì)沉降后,肥料成分不可能象水培法那么均勻,那么易移動。但砂培的研究結(jié)果可直接應(yīng)用到林業(yè)實踐中。我國南方山地缺磷少氮，隨著杉木經(jīng)營的集約化，杉木施肥已是杉木營林必需的措施，其施肥理論和施肥技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，獲得的宏觀結(jié)果[32-35,37]與本研究微觀水平的研究結(jié)果相一致：施氮（或磷肥）既能促進(jìn)氮（磷）的吸收，又能促進(jìn)磷（氮）的吸收。

由于缺乏參考基因組信息，本研究只能運(yùn)用無參轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，得到的差異基因信息的準(zhǔn)確度可能會受到了限制。但目前對于大基因組的針葉樹的測序幾乎都是采用de novo 拚接，然后采用BLASTX 進(jìn)行注釋，進(jìn)行差異基因分析，這樣做肯定會有一定的、可允許的拚接誤差。

施肥誘導(dǎo)基因響應(yīng)的分子機(jī)制，得到了明確的結(jié)果，12個新根樣本的轉(zhuǎn)錄組分析，獲得了74 288個unigenes；施肥可以開啟一些基因上調(diào)表達(dá)，同時也可關(guān)閉一些基因表達(dá)（基因沉默），還可調(diào)節(jié)一些基因下調(diào)表達(dá)。更多的情形是引發(fā)基因差異表達(dá)不顯著。由于針葉樹的轉(zhuǎn)基因分子育種瓶頸效應(yīng)一時難以克服，今后一段時間內(nèi)的研究方向是,對杉木轉(zhuǎn)錄組分析獲得的重要基因，研究其吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)和利用途徑，其結(jié)果可用于指導(dǎo)杉木施肥和杉木營養(yǎng)遺傳育種MAS 選擇。目前吳小波等[36]也對珙桐DiCCoAOMT1基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)研究，分析了珙桐CCoAOMT基因家族的表達(dá)規(guī)律，并克隆分析了其中一個與木質(zhì)素積累關(guān)系密切的基因DiCCoAOMT1，為后續(xù)進(jìn)一步探索珙桐內(nèi)果皮發(fā)育，木質(zhì)素的積累，種子休眠等生理過程的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。這也為珙桐展開分子育種邁出了第一步。

本研究發(fā)現(xiàn)：Illumina 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是非模式植物（包括具有較大基因組的針葉樹）發(fā)現(xiàn)基因和研究基因表達(dá)譜的一種快速、簡便的方法。杉木新根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因表達(dá)信息表明：杉木施肥既會開啟和上調(diào)一些基因，同時又會關(guān)閉和下調(diào)一些基因，其生長發(fā)育的調(diào)控是，向著有利杉木適應(yīng)環(huán)境、競爭資源和生長發(fā)育的方向發(fā)展。