李 遷，祁 青，楊曉倩，楊芳明,3，林澤民，陳付學(xué)，唐 煒，左建平

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 中國科學(xué)院上海藥物研究所；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

銀屑病(psoriasis)是多因素誘導(dǎo)的易復(fù)發(fā)慢性炎癥性自身免疫性皮膚病，影響著全世界2%～3%的人口，我國銀屑病總患病率為0.123%[1-2]。其臨床癥狀表現(xiàn)為表面被覆銀白色鱗屑的紅斑及皮膚增厚，病理變化主要包括角質(zhì)細(xì)胞增殖與分化異常、棘層肥厚、真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張和增生以及慢性炎癥。目前治療銀屑病的方法主要包括藥物治療、生物治療、物理治療和心理治療。

2-羥基丁酸甲酯(4-(6-aminopurine-9-yl)-2-hydroxybutyric acid methyl ester，DZ2002) 是可逆型S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)抑制劑。SAHH是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的水解酶，能將S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，AdoHcy)水解為同型半胱氨酸和腺苷，當(dāng)SAHH被抑制時(shí)，AdoHcy堆積，從而反饋性地抑制細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)。前期研究表明，DZ2002具有高效的體內(nèi)外免疫抑制活性，不僅抑制淋巴細(xì)胞的增殖和炎癥因子的表達(dá)，而且DZ2002通過調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptors)信號(hào)介導(dǎo)的抗原遞呈細(xì)胞反應(yīng)，有效改善NZB/W F1小鼠狼瘡綜合征。目前，DZ2002作為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)候選新藥已在開展臨床研究。研究表明，銀屑病患者角質(zhì)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)高甲基化，導(dǎo)致與角質(zhì)細(xì)胞增殖、T細(xì)胞極化等相關(guān)的蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生[3]?；贒Z2002較強(qiáng)的免疫抑制活性，本實(shí)驗(yàn)室開展了DZ2002軟膏治療銀屑病的療效及作用機(jī)制研究。在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型中，DZ2002明顯改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損，同時(shí)抑制炎癥因子的產(chǎn)生，表現(xiàn)出良好的療效作用[4]。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，探索DZ2002在鹽酸普萘洛爾(Propranolol hydrochloride)誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病模型中的療效及其作用機(jī)制，為候選新藥DZ2002治療銀屑病外用制劑的開發(fā)提供研發(fā)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哈托萊豚鼠，♂，清潔級(jí)，體質(zhì)量為(250～300) g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于上海藥物研究所動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2013-0049號(hào)，溫度為(22±1)℃，相對(duì)濕度為55%±5%，12 h光照，晝夜循環(huán)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物護(hù)理機(jī)構(gòu)倫理指南進(jìn)行，并獲得中國科學(xué)院上海藥物研究所動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株HaCaT、THP1及Jurkat細(xì)胞均購自ATCC(Rockville，MD，USA)。HaCaT細(xì)胞是永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞系；THP1細(xì)胞是人外周血單核-巨噬細(xì)胞系；Jurkat細(xì)胞是人急性白血病T淋巴細(xì)胞系。HaCaT及Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；THP1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 試劑Bio-Plex ProTMReagent Kit Ⅲ 1×96-well Flat Bottom Plate，171304090M，BIO-RAD公司；Human IL-8 ELISA MAXTMDeluxe Set，431504，Biolegend公司。DZ2002原料藥物純度>0.99，呈白色粉末狀，以培養(yǎng)基配制成50 mmol·L-1儲(chǔ)液存儲(chǔ)于-30 ℃，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；20 mg·g-1DZ2002軟膏及軟膏基質(zhì)，自制，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；卡泊三醇軟膏(Calcipotriol Ointment)，0.05 mg·g-1，國藥準(zhǔn)字H20113541，重慶華邦制藥有限公司；鹽酸普萘洛爾由江蘇云陽集團(tuán)藥業(yè)有限公司贈(zèng)予；總RNA提取試劑盒，DP419，TIANGEN公司；SYBR? Green Realtime PCR Master Mix，841200，TOYOBO公司；PrimeScriptTMRT Master Mix，RR036A，TaKaRa公司；Recombinant Human TNF-α，300-01A，PeproTech公司；Recombinant Human IFN-γ，300-02-20，PeproTech公司；Calcein AM，564061，BD Pharmingen公司；Anti-Myeloperoxidase (MPO) pAb，GB11224，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器Bio-Plex 200? System，BIO-RAD公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；HFsafe-1500LC型生物安全柜(中國上海力申科學(xué)儀器有限公司)；7900HT型PCR儀(德國life technologies)；SpectraMAX190型酶標(biāo)儀(MOLECULAR DEVICES)；DM6500型正置顯微鏡、TCS SPS共聚焦顯微鏡(德國Leica)。

1.5 方法

1.5.1豚鼠模型的建立及給藥 以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾搽劑涂抹于豚鼠耳朵背部，20 μL/耳，每天2次，連續(xù)造模5周，建立豚鼠銀屑病模型。將模型豚鼠隨機(jī)分為Vehicle組、Calcipotriol組和DZ2002組，另以正常豚鼠作為Normal組，每組10只。從造模第4周開始給藥，按組別分別將卡泊三醇軟膏、20 mg·g-1DZ2002軟膏或軟膏基質(zhì)涂抹于豚鼠耳部，每組涂抹劑量均為每次50 mg，每天2次，連續(xù)給藥2周。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)將豚鼠安樂死，取耳朵用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2組織病理學(xué)觀察 采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察豚鼠耳部皮膚的病理改變。在10×20視野下觀察并攝圖，對(duì)選中視野進(jìn)行病理學(xué)Baker評(píng)價(jià)及表皮厚度的測(cè)量。Baker評(píng)分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：Munro微膿腫-2.0分；角化過度-0.5分；角化不全-1.0分；顆粒層變薄或消失-1.0分；棘層肥厚-1.0分；表皮突延長或起伏-0.5分(輕)、1.0分(中)、1.5分(重)；真皮層細(xì)胞浸潤-0.5分(輕)、1.0分(中)、2.0分(重)；乳突上頂-0.5分；毛細(xì)血管擴(kuò)張-0.5分。

1.5.3免疫組化實(shí)驗(yàn) 將豚鼠耳朵皮膚石蠟標(biāo)本脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，封閉，MPO抗體孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下觀察豚鼠皮膚細(xì)胞浸潤。用光鏡在10×20視野下觀察并攝圖。

1.5.4HaCaT角質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)及給藥 HaCaT角質(zhì)細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種于6孔板，共接種2塊6孔板，貼壁過夜。設(shè)立對(duì)照組、模型組及給藥組，均為雙復(fù)孔：對(duì)照組為空白培養(yǎng)基，模型組以TNF-α(10 μg·L-1)和IFN-γ(10 μg·L-1)共刺激，給藥組在模型組基礎(chǔ)上加入100 μmol·L-1DZ2002干預(yù)，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中一塊6孔板培養(yǎng)6 h，去掉上清，每孔加入1 mL 裂解液RZ，反復(fù)吹打讓細(xì)胞充分裂解，后期用于RT-PCR分析；另一塊6孔板培養(yǎng)24 h，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于ELISA和luminex多因子檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5.5RT-PCR 按總RNA提取試劑盒說明書提取上述所得RNA。提取完成后測(cè)濃度、定量。在10 μL體系下，于qPCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)IL-8和CXCL9的基因表達(dá)水平。IL-8引物序列：F：5′-TT TTGCCAAGGAGTGCTAAAGA-3′，R：5′-AACCCTCTG CACCCAGTTTTC-3′；CXCL9引物序列：F：5′-CCAG TAGTGAGAAAGGGTCGC-3′，R：5′-AGGGCTTGGGG CAAATTGTT-3′；GAPDH引物序列：F：5′-GGAGC GAGATCCCTCCAAAAT-3′，R：5′-GGCTGTTGTCATA CTTCTCATGG-3′。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5.6ELISA趨化因子水平的檢測(cè) 分別采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中趨化因子IL-8和luminex多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清中趨化因子CXCL9的水平，根據(jù)試劑盒說明書所示的操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.7細(xì)胞趨化試驗(yàn) HaCaT角質(zhì)細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁過夜。設(shè)立對(duì)照組，模型組及給藥組：對(duì)照組為空白培養(yǎng)基，模型組以TNF-α(10 μg·L-1)和IFN-γ(10 μg·L-1)共刺激，給藥組在模型組基礎(chǔ)上加入100 μmol·L-1DZ2002干預(yù)。于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集各組上清用于趨化實(shí)驗(yàn)。以Calcein AM標(biāo)記THP1細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞。在Transwell板的下室分別加入600 μL/孔的各組條件上清，上室加入1×105個(gè)細(xì)胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別進(jìn)行THP1和Jurkat細(xì)胞的趨化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，在熒光顯微鏡下拍照，再收集下室中液體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 DZ2002軟膏改善鹽酸普萘洛爾誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病模型以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾搽劑建立豚鼠銀屑病模型，觀察DZ2002軟膏對(duì)該銀屑病模型的治療作用。造模后豚鼠耳部出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑及增厚，以20 mg·g-1DZ2002軟膏干預(yù)后，皮損明顯減輕；HE染色結(jié)果顯示，Normal組豚鼠耳背部皮膚角質(zhì)層菲薄、顆粒層約1～3層、棘層較薄，表皮與真皮交界處平整；Vehicle組可見角化過度、角化不全、棘層肥厚、炎性細(xì)胞浸潤、Munro微膿腫、顆粒層變薄或消失，表皮突向下延伸等病理特征。20 mg·g-1DZ2002軟膏干預(yù)能明顯改善豚鼠耳部皮膚病理表現(xiàn)。相較于Vehicle組，DZ2002組豚鼠耳部皮膚Baker評(píng)分(P<0.01)及表皮厚度(P<0.01)均明顯降低，見Fig 1。

2.2 DZ2002軟膏降低銀屑病豚鼠耳部皮膚MPO的表達(dá)炎性細(xì)胞浸潤是銀屑病的病理改變之一，因此，通過免疫組化方法檢測(cè)豚鼠耳部皮膚中MPO的表達(dá)。Vehicle組豚鼠耳部皮膚真皮層和表皮層MPO的表達(dá)增加，而DZ2002軟膏干預(yù)后，豚鼠耳部皮膚MPO表達(dá)明顯減少，見Fig 2。

2.3 DZ2002下調(diào)活化的HaCaT細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8及CXCL9活化的角質(zhì)細(xì)胞能分泌趨化因子誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤到銀屑病皮損部位，因而我們以TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)細(xì)胞的活化為模型，檢測(cè)DZ2002對(duì)角質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子的影響。TNF-α/IFN-γ能夠誘導(dǎo)HaCaT表達(dá)趨化因子IL-8和CXCL9，而DZ2002體外給藥能降低IL-8(P<0.01)和CXCL9(P<0.05)的mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)分泌，與模型組比較差異有顯著性，見Fig 3。DZ2002能輕度減少趨化因子CXCL1、CXCL2、IP-10的分泌，但對(duì)趨化因子CXCL11和CCL2的分泌無明顯影響。

Fig 1 Effect of DZ2002 cream on guinea pig model of

A: Ear appearance of guinea pigs in each group; B: Representative HE staining(×200) of the ear skin in each group, bar=100 μm; C: Bakerscores of the lesions; D: Epidermal thickness was evaluated.**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsvehicle.

Fig 2 Infiltration of neutrophils in guinea pig ear skin reduced by DZ2002 cream(×200,n=3)

2.4 DZ2002抑制THP1及Jurkat細(xì)胞的遷移由于DZ2002能夠抑制趨化因子的表達(dá)，故而采用上述相同條件下培養(yǎng)24 h的條件上清進(jìn)行趨化試驗(yàn)，觀察DZ2002對(duì)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響。DZ2002干預(yù)后的HaCaT細(xì)胞上清中，人單核-巨噬細(xì)胞THP1與人T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞遷移的數(shù)量較模型組明顯降低(THP1：P<0.01；Jurkat：P<0.01),見Fig 4。

3 討論

銀屑病是浸潤免疫細(xì)胞和活化角質(zhì)形成細(xì)胞之間異常相互作用的結(jié)果，是免疫介導(dǎo)的皮膚炎癥[5]。銀屑病患者皮膚常伴有銀白色鱗屑覆蓋的紅斑、增厚等皮損，表皮出現(xiàn)明顯的棘層增生、角化過度、角化不全、表皮突向下延伸等，真皮層有明顯的血管增生和擴(kuò)張、乳突上頂?shù)炔±砀淖僛6]。研究表明將50 g·L-1鹽酸普萘洛爾涂抹于豚鼠皮膚，引起豚鼠皮膚出現(xiàn)角化異常、棘層肥厚等類似人銀屑病的病理改變，豚鼠銀屑病模型已經(jīng)成為研究銀屑病藥物治療的經(jīng)典模型之一。在此，以豚鼠銀屑病模型為研究對(duì)象，探索DZ2002對(duì)豚鼠銀屑病模型的治療作用及機(jī)制。以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾造模后，豚鼠皮膚出現(xiàn)典型的銀屑病癥狀及組織病理學(xué)改變，DZ2002涂抹后，皮損及角化異常、細(xì)胞浸潤等病理改變均得到明顯改善。

A: HaCaT cells were pre-incubated with medium or DZ2002 for 1 h and then stimulated with TNF-α(10 μg·L-1)/IFN-γ(10 μg·L-1) or not for 6 h. Total RNA was extracted, and mRNA levels were measured by RT-PCR; B: HaCaT cells were pre-incubated with medium or DZ2002 for 1 h and then stimulated with TNF-α(10 μg·L-1)/IFN-γ(10 μg·L-1) or not for 24 h. Protein levels of IL-8 and CXCL9 in supernatants were detected by ELISA or Luminex x-MAP technology.**P<0.01vscells;#P<0.05,##P<0.01vsTNF-α/IFN-γ-treated cells.

當(dāng)皮膚損傷、感染或發(fā)生炎癥時(shí)，活化的角質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥性趨化因子招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤到炎癥部位[7-8]，在銀屑病患者皮損區(qū)檢測(cè)到趨化因子IL-8和CXCL9的高表達(dá)以及T細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤[9]。浸潤的炎性細(xì)胞分泌炎性因子促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖、異常分化、分泌趨化因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)表皮和血管增生、炎性細(xì)胞浸潤，形成炎性反饋循環(huán)，加重銀屑病[5]。這說明角質(zhì)細(xì)胞異常活化、趨化因子及炎性細(xì)胞對(duì)銀屑病發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的。同時(shí)臨床研究表明，應(yīng)用IL-8單克隆抗體乳膏可以安全、有效地治療尋常型銀屑病[10]；美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的上市藥物如infliximab和secukinumab通過迅速下調(diào)趨化因子的表達(dá)、減少細(xì)胞浸潤從而改善銀屑病[11-12]。在豚鼠銀屑病模型中，我們觀察到表皮及真皮層均出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤，DZ2002能明顯減少豚鼠皮膚炎性細(xì)胞的浸潤。在銀屑病皮損組織中，浸潤的細(xì)胞涉及固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，而中性粒細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用能維持或加重銀屑病癥狀[13]；通過皮內(nèi)注射 IL-23 誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠皮膚炎癥，被發(fā)現(xiàn)在皮膚炎癥部位單核-巨噬細(xì)胞的浸潤明顯增多，并在人銀屑病皮膚皮損區(qū)也發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的Th1、Th17等多種T細(xì)胞亞群的明顯增加[14-15]。為了進(jìn)一步探索DZ2002的作用機(jī)制，應(yīng)用人的角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT模型，研究發(fā)現(xiàn)DZ2002不僅明顯下調(diào)活化的HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-8和CXCL9，而且能抑制人巨噬細(xì)胞系THP1細(xì)胞和人T淋巴細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。

本研究的結(jié)果表明：DZ2002軟膏能有效抑制豚鼠銀屑病模型的皮膚角質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎性細(xì)胞浸潤，減輕局部炎癥反應(yīng)，對(duì)銀屑病具有良好的治療作用。本研究進(jìn)一步拓展了SAHH抑制劑DZ2002臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥，為研發(fā)新型抗銀屑病藥物提供研發(fā)基礎(chǔ)。

A: Fluorescence images of THP1 and Jurkat cells in chemotaxis assays, bar = 100 μm; B: The numbers of the migrated cells were detected.*P<0.05,**P<0.01vscontrol medium;##P<0.01vsTNF-α/IFN-γ-treated cells supernatant.

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國科學(xué)院上海藥物研究所免疫藥理研究室和抗炎免疫藥理研究室完成，衷心感謝給予本實(shí)驗(yàn)幫助的所有老師和同學(xué)。)