閆巧珍，李瑋鈺，李玥霞，王曉聞，朱俊玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西功能食品研究院，山西 太谷 030801)

小米又名粟，屬禾本科，是五谷之首。小米中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚活性物質(zhì)及優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸等，易被人體吸收利用[1]。小米中的多酚類物質(zhì)含量較高，種類較多，包含黃酮類、單寧類、酚酸類、花色苷類等，尤其是黃酮類物質(zhì)含量極為豐富，這些生理活性物質(zhì)表現(xiàn)出抗氧化、抑菌、清除自由基、抗衰老等獨(dú)特的生理功能[2]。

目前常用的小米多酚提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等。這些方法存在著得率較低、溶劑浪費(fèi)的缺點(diǎn)。酶法提取技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，生物酶可通過水解植物細(xì)胞壁使細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)溶出，在提取過程中適當(dāng)?shù)丶尤朊赣欣诙喾拥慕?，且反?yīng)溫度較低，可有效提高小米多酚的得率[3]。

目前，在調(diào)味品等食品行業(yè)中，食品添加劑的應(yīng)用十分廣泛，但是市售調(diào)味品中所使用的添加劑大多數(shù)為人工合成，存在著一定的危險(xiǎn)性，如：抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等。所以，天然提取物作為添加劑應(yīng)用在調(diào)味品等食品行業(yè)成為近些年來研究的熱點(diǎn)。丁培峰等[4]將納他霉素和茶多酚添加到醬油中，其防腐、抗氧化效果十分明顯且安全性大大提高。刁文睿等[5]研究了山西老陳醋在浸漬花生的過程中，花生多酚提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力都有顯著增加，說明多酚能很好地應(yīng)用到調(diào)味品行業(yè)，從而提高調(diào)味品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。楊瑞麗等[6]添加茶多酚量達(dá)到0.5%時(shí)，對(duì)花椒油有很好的抗氧化效果。小米多酚中黃酮類化合物極為豐富，研究表明黃酮類作為一種天然色素對(duì)油脂有一定抗氧化作用，因此進(jìn)一步增強(qiáng)其抗氧化性，發(fā)揮小米多酚的抗氧化能力，將這一優(yōu)勢(shì)運(yùn)用到調(diào)味品等食品行業(yè)中，對(duì)提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米(東方亮1號(hào))、大豆油。

纖維素酶(10萬(wàn)U/g)、果膠酶(5萬(wàn)U/g)：南寧龐博生物工程有限公司；沒食子酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；聚甘油酯：鄭州市鴻科化工產(chǎn)品有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)：英博生物科技有限公司；叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)：山東優(yōu)索化工科技有限公司；AB-8大孔樹脂：東鴻化工有限公司；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100 可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SC-3610 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YHG-400-BS-Ⅱ遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；ST3100 實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器(常州)有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FA25 高速組織分散均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；BT-100B數(shù)顯恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將小米粉碎，過80目篩，脫脂、干燥處理后的小米粉密封避光保存。

1.3.2 小米多酚物質(zhì)的提取

精確稱取5 g小米粉，加酶，搖勻。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案，調(diào)節(jié)溶液pH，在設(shè)定的溫度下水浴一定時(shí)間后，冷卻離心，取上清液，得到待測(cè)液Ⅰ。取濾渣，加入70%乙醇，40 ℃下水浴1 h，離心，取上清液，得到待測(cè)液Ⅱ，合并提取液Ⅰ和Ⅱ， 并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，測(cè)定小米多酚得率。

1.3.3 小米多酚物質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度為 0.01 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1，2，3，4，5 mL 配制成的沒食子酸溶液，通過福林酚比色法測(cè)定吸光度。參照王若蘭等[7]采用微波輔助乙醇提取小米多酚的研究，稍加修改。繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 小米多酚含量的測(cè)定

取小米多酚提取液 1 mL，通過福林酚比色法測(cè)定并記錄吸光值，計(jì)算出小米多酚得率，計(jì)算公式如下：

式中：K為提取液的多酚得率(%)；C為與提取液吸光度對(duì)應(yīng)的多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為小米多酚提取液的體積(mL)；W為小米粉末質(zhì)量(g)。

1.3.4 酶法提取小米多酚的單因素試驗(yàn)

精確稱取5 g小米粉，分別加入纖維素酶、果膠酶以及一定比例的混合酶(纖維素酶∶果膠酶為1∶1；纖維素酶∶果膠酶為7∶3；纖維素酶∶果膠酶為3∶7)，其酶濃度分別設(shè)置為0、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其中0為空白對(duì)照；酶解時(shí)間設(shè)置為30，60，90，120，150 min；酶解溫度設(shè)置為30，40，50，60，70 ℃；pH值設(shè)置為2.5，3，3.5，4，4.5，5。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用控制單一變量的方法，探究酶種類和各單因素對(duì)得率的影響，確定各單因素最佳水平[8]。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

以小米多酚得率為響應(yīng)值，探究4個(gè)單因素之間的交互作用與響應(yīng)值的關(guān)系，優(yōu)化酶法提取小米多酚的工藝參數(shù)，從而得出最優(yōu)工藝條件，并且在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.6 小米多酚提取物抗油脂氧化作用試驗(yàn)

按上述方法提取小米多酚凍干成粉，參考王若蘭等[9]采用大孔樹脂分離純化小米多酚的方法和條件，將小米多酚進(jìn)行分離純化，其純度由16.7%提高到了49.2%，提高了2.9倍。

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.37-2003[10]，采用Schaal烘箱法，將不同濃度梯度純化后的小米多酚提取物0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%與乳化劑(4%聚甘油酯)漩渦混合后，加入20 g大豆油進(jìn)行均質(zhì)化處理?；旌暇鶆蚝笾糜?50 mL廣口瓶中，密封放置于60 ℃電熱烘箱中氧化，放置8 d，每隔2 d(第0，2，4，6，8天)定時(shí)取樣測(cè)定其酸價(jià)(AV)和過氧化值(POV)。

通過POV和AV探究不同比例對(duì)小米多酚抗油脂氧化的影響，確定其最佳比例濃度。同時(shí)，在最佳比例濃度下分別與等濃度(不超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)添加量0.02%)TBHQ、BHT、BHA的抗氧化性進(jìn)行比較，探究小米多酚抗氧化性的強(qiáng)弱。

1.3.6.1 POV的測(cè)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的滴定法測(cè)定[11]。

1.3.6.2 AV的測(cè)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的滴定法測(cè)定[12]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件錄入，作圖均采用Origin 9.1進(jìn)行繪制，運(yùn)用 Design-Expert 10.0.8 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，所有試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

由圖1可知，回歸方程為 y=14.65x+0.0559，R2=0.9992。沒食子酸濃度與吸光值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2 復(fù)合酶提取小米多酚的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶種類及濃度的選擇

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，不同酶比例及酶濃度對(duì)小米多酚得率影響結(jié)果見表1。

表1 不同酶在不同濃度下的多酚得率Table 1 Polyphenols yield of different enzymes at different concentration

由表1可知，當(dāng)纖維素酶∶果膠酶的比例為7∶3時(shí)，多酚得率最大，說明復(fù)合酶較單一酶作用效果好，故選取復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶為7∶3)用作后續(xù)試驗(yàn)研究。其他條件不變時(shí)，通過無(wú)酶溶劑萃取得到的多酚得率僅為0.66%。隨著酶濃度的增加，多酚得率增加，酶濃度大于1.0%時(shí)，多酚得率沒有顯著增大，這可能是因?yàn)槊负偷孜锝佑|受到限制。隨著酶濃度的升高，反應(yīng)過程中逐漸消耗底物，使過量的酶不能充分發(fā)揮作用?？紤]到成本，確定最佳酶濃度為1.0%，此時(shí)小米多酚得率為1.35%。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)小米多酚得率的影響

設(shè)定單一變量為酶解時(shí)間，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取小米多酚，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)小米多酚得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of millet polyphenols

多酚得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，當(dāng)時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)多酚得率最高。當(dāng)酶解時(shí)間小于90 min 時(shí)，由于時(shí)間過短，使多酚無(wú)法充分溶出，導(dǎo)致得率偏低；當(dāng)酶解時(shí)間大于90 min時(shí)，由于時(shí)間過長(zhǎng)，酚酸類物質(zhì)發(fā)生氧化分解，導(dǎo)致多酚得率偏低。因此，酶解時(shí)間選為90 min，此時(shí)小米得率為1.41%[13]。

2.2.3 酶解溫度對(duì)小米多酚得率的影響

設(shè)定單一變量為酶解溫度，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取小米多酚，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)小米多酚得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

由圖3可知，多酚得率隨著溫度的升高先升高后降低，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)得率最高。當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，酶容易受熱變性使活性降低。此外，小米多酚得率明顯下降可能是提取溫度過高，多酚物質(zhì)對(duì)熱極不穩(wěn)定，使得多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到破壞，直接影響了多酚的得率。因此，酶解溫度選為 60 ℃，此時(shí)小米多酚得率為1.15%。

2.2.4 pH對(duì)小米多酚得率的影響

設(shè)定 pH值為單一變量，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取小米多酚，結(jié)果見圖 4。

圖4 pH值對(duì)小米多酚得率的影響Fig.4 Effect of pH values on the yield of millet polyphenols

由圖4可知，當(dāng) pH 值低于3時(shí)，隨著pH值增加，多酚得率顯著增加；當(dāng)pH值為3時(shí)，得率達(dá)到最大；當(dāng)pH值大于3時(shí)，多酚得率逐漸降低，表明酶活性受到pH影響，酶的構(gòu)象和底物的解離狀態(tài)發(fā)生變化[14]。因此，確定最佳pH值為3，小米得率為1.11%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design test results

運(yùn)用 Design-Expert 10.0.8軟件對(duì) 29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，擬合后各個(gè)單因素的回歸模型為：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C+2.500E-003D+0.015AB-5.000E-003AC+5.000E-003AD-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2,調(diào)整后得：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2。

方差分析見表4，回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3678)，證明可用本模型進(jìn)行試驗(yàn)分析和預(yù)測(cè)， R2=95.18%，RAdj2=90.36%，說明回歸擬合度較好。各考察因素對(duì)小米多酚得率影響順序依次為：A>C>B>D，即：酶濃度>酶解溫度>酶解時(shí)間>pH值。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

注：“*”表示顯著(0.01

2.3.2 各因素相互作用對(duì)小米多酚得率的影響

該試驗(yàn)建立的模型中C，D的交互項(xiàng)在0.01水平極顯著，B，C和B，D的交互項(xiàng)在0.05水平顯著。因此，各測(cè)試因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，僅靠簡(jiǎn)單的單因素試驗(yàn)不足以確定最佳工藝參數(shù)。C與D、B與C、B與D的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響見圖5～圖7。

圖5 酶解溫度和pH值對(duì)小米多酚得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on the yield of millet polyphenols

圖6 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)小米多酚得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

圖7 酶解時(shí)間和pH值對(duì)小米多酚得率的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time and pH value on the yield of millet polyphenols

由圖5～圖7可知，C與D、B與C、B與D兩兩之間存在著相互作用，尤其是C與D之間更為顯著。由響應(yīng)面圖可知，C與D之間曲面陡峭，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，B與C、B與D之間曲面較為陡峭，等高線圖較為橢圓，這與方差分析的結(jié)果相符合[15]。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)

在-1～1水平內(nèi)，各因素對(duì)響應(yīng)值都有一個(gè)最優(yōu)條件。根據(jù)分析得出最優(yōu)值，即纖維素酶濃度為 1.072%，酶解時(shí)間為88.157 min，酶解溫度為57.704 ℃，pH值為2.969。此時(shí)，模型預(yù)測(cè)值為1.529%。考慮試驗(yàn)的實(shí)際性和合理性，選擇酶濃度為1.1%，酶解時(shí)間為88 min，酶解溫度為58 ℃，pH值為3.0，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得小米多酚的得率為1.521%±0.004%，與預(yù)測(cè)值十分接近，表明通過響應(yīng)面法試驗(yàn)得到的結(jié)論是可靠的。

2.4 小米多酚抗油脂氧化試驗(yàn)

2.4.1 小米多酚最佳混合比例的確定

通過對(duì)大豆油的AV和POV進(jìn)行定時(shí)測(cè)定，分別得出0，2，4，6，8 d后各小米多酚濃度對(duì)大豆油酸敗抑制效果的影響，見圖8和圖9。

圖8 不同濃度小米多酚添加量對(duì)大豆油酸價(jià)的影響Fig.8 Effect of different concentration of millet polyphenols on the acid value of soybean oil

圖9 不同濃度小米多酚添加量對(duì)大豆油過氧化值的影響Fig.9 Effect of different concentration of millet polyphenols on the peroxide value of soybean oil

由圖8和圖9可知，大豆油的AV和POV隨加速氧化時(shí)間的延長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組和各個(gè)試驗(yàn)組均表現(xiàn)出一定的酸敗，高溫加快油脂的酸敗速度。各試驗(yàn)組所測(cè)定的AV和POV均高于空白對(duì)照組，說明小米多酚對(duì)大豆油的氧化能夠起到一定的抑制作用。加速氧化到第8天時(shí)，對(duì)照組與各試驗(yàn)組的AV和POV均出現(xiàn)較大的差距，酸敗程度不一。當(dāng)小米多酚的濃度小于0.02%時(shí)，大豆油的AV與POV和小米多酚的添加濃度呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，當(dāng)小米多酚的添加量為0.02%時(shí)，AV和POV最低，分別為3.0 mg/g和0.54 g/100 g，僅為空白對(duì)照組的65.2%、64.96%。當(dāng)多酚濃度大于0.02%時(shí)，AV和POV繼續(xù)升高，不再呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，抗氧化效果減弱。這可能是因?yàn)槎喾颖谎趸蟪霈F(xiàn)副反應(yīng)產(chǎn)生自由基后引發(fā)了連鎖反應(yīng)，故濃度較高的多酚對(duì)油脂抗氧化表現(xiàn)出較差的效果。

2.4.2 小米多酚與抗氧化劑抗氧化效果的比較

0.02%小米多酚濃度為抑制大豆油酸敗的最佳濃度，將此濃度下的小米多酚與人工合成的抗氧化劑(BHA、BHT、TBHQ)進(jìn)行抗氧化效果的比較。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定BHA、BHT、TBHQ在基本不含水的脂肪和油中最大添加量為0.2 g/kg[16]，故可采用等濃度的抗氧化劑進(jìn)行試驗(yàn)。通過POV和AV的測(cè)定，得出小米多酚與其他抗氧化劑抗油脂氧化效果，見圖10和圖11。

圖10 小米多酚與BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油AV的比較Fig.10 Comparison of soybean oil acid value under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

圖11 小米多酚與BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油POV的比較Fig.11 Comparison of peroxide value of soybean oil under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

對(duì)照組和各試驗(yàn)組的AV和POV均呈上升趨勢(shì)，且高溫加快了氧化速度，空白對(duì)照(CK)的POV與AV都明顯高于各試驗(yàn)組，各種抗氧化劑都體現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化性能。第8天測(cè)定時(shí)，各試驗(yàn)組的POV與AV分別為小米多酚：0.56 g/100 g，3.0 mg/g；BHA：0.6 g/100 g，3.4 mg/g；BHT：0.68 g/100 g，3.6 mg/g；TBHQ：0.48 g/100 g，2.6 mg/g，得出抗氧化效果由高到低依次為：TBHQ>小米多酚>BHA>BHT。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用酶法提取小米多酚，得出最佳工藝條件為：在纖維素酶和果膠酶的最佳比例為7∶3的條件下，選擇酶濃度為1.1%，酶解時(shí)間為88 min，酶解溫度為58 ℃，pH值為3，得出小米多酚得率為1.521%±0.004%。在小米多酚的抗油脂氧化試驗(yàn)中，當(dāng)小米多酚的添加量為0.02%時(shí)，抗氧化效果最佳，與同等濃度的人工合成抗氧化劑相比，其抗氧化性強(qiáng)于BHA和BHT，遜色于TBHQ，體現(xiàn)出良好的抗氧化性能。故將小米多酚提取物作為添加劑運(yùn)用到芝麻油、蠔油、蝦油、橄欖油等調(diào)味中具有重大的現(xiàn)實(shí)意義，能夠在改善食品味道的同時(shí)提高其安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。