許世富

摘要? ? 利用高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量。采用C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），在室溫下，以甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（66∶33∶1，V/V/V）為流動(dòng)相，250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流速1.0 mL/min。結(jié)果表明，甘草酸在4.90～195.90 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為91.97%，RSD為3.41%。本方法簡(jiǎn)單快捷、精密度好，可用于控制清肺顆粒中甘草酸的含量。

關(guān)鍵詞? ? 清肺顆粒;甘草酸;HPLC

中圖分類號(hào)? ? TS201? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）07-0222-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Determination? of? Glycyrrhizic? Acid? Content? in? Qingfei? Granule? by? HPLC

XU Shi-fu

（Anhui Provincial Control Institute of Veterinary Pharmaceuticals and Feed，Hefei Anhui 230091）

Abstract? ? The content of glycyrrhizic acid in qingfei granule was determined by HPLC.Using C18 column（5 μm，4.6 mm×250 mm）at room temperature，methanol-0.2 mol/L ammonium acetate solution-glacial acetic acid（66∶33∶1，V/V/V）was used as mobile phase，the detection wavelength was 250 nm，the flow rate was 1.0 mL/min.The results showed that the glycyrrhizic acid had a good linear relationship（r=0.999 9） in the range of 4.90～195.90 μg/mL，the average recovery was 91.97% and RSD was 3.41%.The method is simple，rapid and accurate，and can be used to control the content of glycyrrhizic acid in qingfei granules.

Key words? ? qingfei granule;glycyrrhizic acid;HPLC

清肺顆粒為獸藥中常用中藥顆粒劑，收載于《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]，由板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗和甘草等藥材組成，采用提取精制的方法制成，具有清肺平喘、化痰止咳之功能，臨床主治肺熱咳嗽，咽喉腫痛。目前，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)浙貝母、板藍(lán)根、甘草和桔梗進(jìn)行薄層色譜法鑒別。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，建立了測(cè)定清肺顆粒中甘草酸含量的高效液相色譜法。結(jié)果表明，本方法具有結(jié)果準(zhǔn)確、快速分離、操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可為有效控制清肺顆粒的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 儀器和設(shè)備。U3000高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛;電子天平，BT-125D，德國(guó)賽多利斯;超純水器，Milipo Simplicity，美國(guó)密理博;超聲波儀，KQ-300DV，昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2? ? 試劑。甲醇為色譜純;醋酸銨、冰醋酸為分析純;水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。對(duì)照品：甘草酸銨，含量93.0%，批號(hào)110731-201619，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。清肺顆粒（每100 g相當(dāng)于原生藥100 g）3批，批號(hào)分別為20191101、20191102、20191103，來(lái)源于安徽XX生物科技有限公司。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 溶液制備。①對(duì)照品溶液制備。取甘草酸銨對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液，每1 mL含甘草酸銨1 mg（相當(dāng)于含甘草酸0.979 5 mg）;吸取對(duì)照品貯備溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，每1 mL含甘草酸銨0.2 mg（相當(dāng)于含甘草酸0.195 9 mg）。②供試品溶液制備。取研細(xì)的清肺顆粒粉末約2.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相約45 mL，超聲25 min，放至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。③陰性對(duì)照溶液制備。按處方及制法制備不含甘草的陰性制劑，按上述供試品溶液制備方法，制備相應(yīng)的陰性對(duì)照溶液。④溶液制備。0.2 mol/L醋酸銨溶液配制：取醋酸銨15.4 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。流動(dòng)相配制：分別取甲醇、0.2 mol/L醋酸銨溶液、冰醋酸，按體積比（66∶33∶1）配制，混勻，過(guò)濾脫氣，即得。

1.2.2? ? 色譜條件。色譜柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相：甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（66∶33∶1，體積比）。流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，甘草酸峰與相鄰峰分離良好，陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，專屬性強(qiáng)，能滿足檢測(cè)要求（圖1～3）。

2.2? ? 線性關(guān)系考察

吸取對(duì)照品貯備溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為4.90、9.80、19.59、48.98、97.95、195.90 μg/mL的對(duì)照品系列溶液，分別取10 μL注入高效液相色譜儀。在1.2.2項(xiàng)下的色譜條件下測(cè)定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，甘草酸濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4，回歸方程為Y=0.124 4X+0.014 7，R2=0.999 9。

2.3? ? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h，按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果分別為11.313、11.342、11.282、11.388、11.361、11.378，平均11.344，RSD（n=6）為0.36%，表明在24 h內(nèi)測(cè)定，其含量基本穩(wěn)定。

2.4? ? 精密度試驗(yàn)

取清肺顆粒（批號(hào)為20191101），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積。連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得甘草酸銨峰面積分別為11.341、11.295、11.327、11.358、11.362、11.333，平均11.336，RSD（n=6）為0.21%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性好。

2.5? ? 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取已知甘草酸含量的清肺顆粒，研細(xì)，稱取9份，每份約1.125 g，分成3組，每組3份，分別加入一定的甘草酸銨對(duì)照品貯備溶液，3組分別以樣品含量的80%、100%和120%為梯度添加。按供試品溶液制備方法制備，按1.2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積計(jì)算出甘草酸測(cè)得量?；厥章视?jì)算公式：回收率（%）=（測(cè)得量-供試品中含量）/添加量×100。結(jié)果表明，甘草酸的回收率在87.09%～96.94%之間，平均回收率為91.97%（表1），RSD為3.41%。

2.6? ? 樣品測(cè)定

取清肺顆粒3批（批號(hào)分別為20191101、20191102、20191103），分別按供試品制備方法制備，按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積用外標(biāo)法計(jì)算甘草酸含量。結(jié)果表明，3批清肺顆粒中甘草酸的含量分別為2.015、2.013、2.009 mg/g。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究選擇高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量，該方法快捷簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、回收率高，可有效控制該制劑中甘草酸的含量，為清肺顆粒標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

3.1? ? 質(zhì)控成分的選擇

清肺顆粒收載于《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]，具有清肺平喘、化痰止咳功效，臨床用于病毒感染引起的肺熱咳嗽和咽喉腫痛。處方中含有板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗和甘草等，其中甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳等功效，對(duì)整個(gè)方劑具有重要的輔助作用，《中國(guó)獸藥典》2015年版二部?jī)H對(duì)浙貝母、板藍(lán)根、甘草和桔梗進(jìn)行薄層色譜法鑒別，選擇測(cè)定其中甘草酸含量有助于對(duì)清肺顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制。甘草中含有多種三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿等多種成分[4-5]，三萜類化合物中甘草酸（又稱甘草皂苷）是主要活性成分，其含量一般不低于2%[1]。因此，選擇測(cè)定甘草酸含量作為其中質(zhì)控方法之一。本方法采用HPLC法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸含量，操作便捷快捷，而且甘草酸在4.90～195.90 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性均能達(dá)到要求。

3.2? ? 提取方法的選擇

參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]甘草顆粒含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本試驗(yàn)采用酸性甲醇溶液作為提取溶劑，以超聲的方式進(jìn)行提取，試驗(yàn)時(shí)間選擇20、25、30 min進(jìn)行比較，最終選擇流動(dòng)相作為提取溶液，采用超聲方式處理25 min。結(jié)果證明該方法提取效果好、速度快，而且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.3? ? 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行掃描，甘草酸在（252±2）nm處有最大吸收，參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]，最終選擇250 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)（圖5）。

3.4? ? 流動(dòng)相的選擇

筆者考察了不同比例的甲醇對(duì)分離效果的影響，通過(guò)調(diào)整有機(jī)相比例不斷優(yōu)化分離度和檢測(cè)效率，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的提高，甘草酸的保留時(shí)間不斷縮短，在滿足分離度要求的前提下，最終選擇了甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（66∶33∶1）作為流動(dòng)相，保留時(shí)間較短，分離度符合要求[6]。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[S].2部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 豆康寧，尚新彬，王飛.HPLC法測(cè)定甘草中甘草酸的含量與分布[J].中國(guó)食品添加劑，2017，5（2）：199-203.

[3] 孟慶山，王嘉偉，楚合法，等.高效液相色譜法測(cè)定甘草鋅顆粒中甘草酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2018，16（13）：28-29.

[4] 中國(guó)藥科大學(xué).中藥辭海（第一卷）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1993：1365.

[5] 程曉霞.甘草及其制劑中甘草酸的定量方法研究概況[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11（4）：380-381.

[6] 白梓靜.高效液相色譜在中藥含量測(cè)定中的應(yīng)用[J].分析儀器，2014（6）：8-11.