黃誠(chéng) 尹紅

摘要? ? 為優(yōu)化桃仁中苦杏仁苷超聲波輔助提取工藝，采用單因素研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲工作時(shí)間、超聲處理溫度6個(gè)因素對(duì)苦杏仁苷得率的影響，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用HPLC法對(duì)桃仁中苦杏仁苷的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、超聲處理時(shí)間30 min、超聲處理溫度70 ℃，同時(shí)此條件下苦杏仁苷的得率為2.88%。

關(guān)鍵詞? ? 苦杏仁苷;超聲波;HPLC

中圖分類號(hào)? ? TS255? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）07-0228-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Optimization? of? Ultrasonic-assisted? Extraction? of? Amygdalin? in? Wild? Peach? Seed

HUANG Cheng? ? YIN Hong

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou Hunan 416000）

Abstract? ? Ultrasonic was used to help extract amygdalin from wild peach seed with ethanol aqueous solution.To optimize the extraction process，the effects of operation parameters such as ethanol concentration，temperature，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic treatment time，ultrasonic treatment temperature were investigated by single-factor experiments.Based on this，a orthogonal trial was used to optimize the operation parameters，and using HPLC method to determine quantitatively the content of amygdalin in wild peach seed.As the result showed，the optimum ultrasonic-associated extraction condition was ethanol concentration of 85%，temperature of 85 ℃，extraction duration of 60 min，liquid-to-solid ratio of 1∶35 g/mL，ultrasonic treatment time of 30 min and ultrasonic treatment temperature of 70 ℃，the amygdalin extraction rate could reach as much as 2.88% under such optimum condition.

Key words? ? amygdalin;ultrasonic;HPLC

桃仁為薔薇科（Rosaceae）植物桃（Prunus persica（L.）Batsch.）或山桃（P. davidiana（Carr.）Franch.）的種仁，性平、味甘、苦，有小毒，歸心、肝、大腸經(jīng)，為常用的活血化淤中藥，具有活血祛淤、潤(rùn)腸通便之效。桃仁主要化學(xué)成分有脂質(zhì)、苷類（苦杏仁苷、野櫻苷）、糖類（葡萄糖、蔗糖等）、蛋白質(zhì)、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊素酶等[1]。其中，苦杏仁苷是山桃仁中主要的藥理成分。山桃仁對(duì)心腦血管疾病療效顯著[2]，也有抗癌作用[3]。研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞無氧降解占優(yōu)勢(shì)，最終產(chǎn)物為乳酸，偏酸性環(huán)境有利于提高β-葡萄糖苷酶的活性，促使苦杏仁苷在腫瘤細(xì)胞中分解出較多的苯甲醛和氫氰酸，從而產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用[4]。武陵山區(qū)野山桃仁資源豐富，湘西自治州永順、保靖、龍山和張家界市的桑植、慈利等縣都進(jìn)行了規(guī)?；N植，故對(duì)其開發(fā)利用意義重大。

目前，對(duì)桃仁中苦杏仁苷提取方法的研究比較多，常用的有水提法、有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2萃取法等[5]。采用超聲波輔助提取可提高效率，減少生產(chǎn)成本。超聲波可破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，從而提高提取率和縮短提取時(shí)間[6]。研究表明，超聲波提取所得到的產(chǎn)品具有雜質(zhì)含量低、有效成分含量高、提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，而且超聲波本身還表現(xiàn)出節(jié)省能源、省時(shí)、簡(jiǎn)化操作程序、提高反應(yīng)率和提取率、顯著降低化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的廢棄物對(duì)環(huán)境所產(chǎn)生的危害等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物天然產(chǎn)物的提取中[7]。

高溫處理可使苦杏仁苷酶滅活，對(duì)桃仁進(jìn)行高溫滅酶的預(yù)處理，將有利于苦杏仁苷成分的保留。本研究通過四因素三水平的正交試驗(yàn)，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定苦杏仁苷，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化桃仁中苦杏仁苷的提取工藝條件并考察其穩(wěn)定性，旨在探討超聲輔助提取桃仁苦杏仁苷的工藝條件，為苦杏仁苷的開發(fā)利用提供相應(yīng)途徑。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 試驗(yàn)儀器。RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SMB-D 型微型循環(huán)水真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;HH-2 數(shù)星恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）;DSY-2-4孔電熱恒溫水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療儀器廠）;高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;GZX-9146 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;液相色譜儀（LC-2010AHT）;JA2003電子天平（上海天平設(shè)備廠）。

1.1.2? ? 試驗(yàn)材料。山桃仁（湖南吉首）;石油醚、乙醇均為分析純，甲醇、磷酸為色譜純;娃哈哈純凈水;苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品（西安森卓生物科技有限公司）。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

苦杏仁苷提取工藝如圖1所示。

1.2.1? ? 山桃仁預(yù)處理。取經(jīng)清洗、去雜后的桃仁，平鋪在烘箱中進(jìn)行滅酶處理，60 ℃烘10 h，取出冷卻后粉碎[8]。將上述粉末過60目篩，稱取細(xì)粉300 g，置250 mL錐形瓶中，加石油醚150 mL于70～80 ℃水浴攪拌提取30 min，趁熱抽濾收集濾液和濾餅，重復(fù)提取3次。

1.2.2? ? 苦杏仁苷超聲輔助提取。稱取5 g脫脂粕置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，以塑料保鮮膜封口，置于超聲波清洗器中，設(shè)定超聲工作時(shí)間、超聲處理溫度，再回流提取，并設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、提取溫度，趁熱抽濾并收集濾液，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，得到粗提取物。

1.2.3? ? 單因素試驗(yàn)。分別探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲工作時(shí)間、超聲處理溫度對(duì)苦杏仁苷得率的影響。

1.2.4? ? 優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，去除對(duì)苦杏仁苷得率影響不大的因素，選擇L9（34）四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到優(yōu)化工藝參數(shù)，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

1.2.5? ? 分析檢測(cè)方法。采用高效液相色譜儀對(duì)苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，求得峰面積與濃度的回歸方程。再對(duì)待測(cè)溶液的峰面積進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用回歸方程計(jì)算測(cè)定液中苦杏仁苷的濃度，最后換算為苦杏仁苷得率。

1.2.6? ? 高效液相色譜儀工作條件。色譜柱為柱Eclipse XDB C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min[9-10]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品12.50 mg加50%甲醇定容至25mL，分別吸取此溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL用50%甲醇定容至25 mL，以20 μL定量閥進(jìn)樣，測(cè)定峰面積A。以苦杏仁苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=183.99X-0.028 6，R2=0.999 9，結(jié)果表明苦杏仁苷濃度在0.012 5～0.250 0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖2）。

2.2? ? 單因素試驗(yàn)

2.2.1? ? 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶40（g∶mL）和超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度60 ℃時(shí)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85% 和95%時(shí)對(duì)苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，苦杏仁苷得率均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，苦杏仁苷得率達(dá)到最大。這可能是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)變性加快，妨礙乙醇溶液向細(xì)胞內(nèi)滲透，阻止了苦杏仁苷的溶出，從而影響了苦杏仁苷提取[11]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。

2.2.2? ? 提取溫度對(duì)苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間2 h、料液比1∶40（g∶mL）、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度60℃時(shí)，考察提取溫度為65、70、75、80、85、90、95 ℃時(shí)對(duì)苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖4?？梢钥闯觯嘈尤受盏寐孰S著提取溫度的升高而增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到85 ℃后，苦杏仁苷得率的增加趨于平緩。這可能是因?yàn)榭嘈尤受赵诶湟掖贾腥芙舛群艿停跓嵋掖贾腥芙舛仍龃?與此同時(shí)，隨著提取溫度的上升，溶液的黏度下降、擴(kuò)散系數(shù)增大，從而促使苦杏仁苷向提取液中擴(kuò)散，從而影響了苦杏仁苷的提取[12]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳提取溫度為85 ℃。

2.2.3? ? 提取時(shí)間對(duì)苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度85 ℃、料液比1∶40（g∶mL）、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度60 ℃，考察提取時(shí)間為20、40、60、80、100、120、140 min時(shí)對(duì)苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，苦杏仁苷得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min后，苦杏仁苷得率變化不明顯。從節(jié)能考慮，本工藝提取苦杏仁苷的最佳提取時(shí)間為60 min。

2.2.4? ? 料液比對(duì)苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間60 min、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度60 ℃時(shí)，分別考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）時(shí)對(duì)苦杏仁苷得率的影響（圖6）。可以看出，苦杏仁苷得率隨著料液比增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶35（g∶mL）后，苦杏仁苷得率趨于平緩。對(duì)于一定質(zhì)量的脫脂粕而言，溶劑用量增加時(shí)，脫脂粕與溶劑接觸界面處的濃度差增加，傳質(zhì)速率提高，提取率增大。當(dāng)溶劑量增大到一定程度后，提取率無明顯變化。從節(jié)省溶劑考慮，本工藝提取苦杏仁苷最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

2.2.5? ? 超聲工作時(shí)間對(duì)苦杏仁苷得率的影響。稱取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲處理溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min，分別設(shè)定超聲工作10、15、20、25、30、35 min條件進(jìn)行提取，考察不同超聲工作時(shí)間對(duì)苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，超聲工作時(shí)間為30 min時(shí)，苦杏仁苷得率達(dá)到最大值。這是因?yàn)楣ぷ鲿r(shí)間短時(shí)，超聲破碎作用較弱，細(xì)胞內(nèi)苦杏仁苷釋放不充分;但當(dāng)超聲工作時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，超聲波破碎作用增大，細(xì)胞的破裂越來越完全，細(xì)胞內(nèi)大量不溶物、淀粉顆粒及黏液質(zhì)等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多、黏度增大，從而影響了苦杏仁苷的溶出[13]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳超聲工作時(shí)間為30 min。

2.2.6? ? 超聲處理溫度對(duì)苦杏仁苷得率的影響。稱取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間60 min、超聲工作時(shí)間30 min，分別設(shè)定超聲處理溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行提取，考察不同超聲處理溫度對(duì)苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖8。可以看出，隨著溫度升高苦杏仁苷的得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度升至70 ℃后，苦杏仁苷的得率反而下降。這可能是由于溫度較低時(shí)提取液的黏度較低，質(zhì)點(diǎn)傳質(zhì)效果好，擴(kuò)散系數(shù)也較大，有利于苦杏仁苷在乙醇中溶解，因而得率逐漸增大;而當(dāng)溫度大于70 ℃后，隨著溫度升高苦杏仁苷的得率反而下降，原因可能是苦杏仁苷中酚羥基在高溫下易被氧化[14]，隨著溫度升高可能會(huì)導(dǎo)致苦杏仁苷被破壞，導(dǎo)致熱敏損失。同時(shí)溫度過高也會(huì)導(dǎo)致桃仁中其他雜質(zhì)成分的溶出，從而抑制苦杏仁苷的提取。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳超聲處理溫度為70 ℃。

2.3? ? 色譜圖

在1.2.6所述工作條件下，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液的色譜圖，結(jié)果見圖9、10。

2.4? ? 優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1? ? 正交試驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)L9（34）四因素三水平（表1）的設(shè)計(jì)原理，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間60 min，選取料液比（A）、提取溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲處理溫度（D）作為考察變量，采用四因素三水平的分析法，對(duì)超聲輔助提取苦杏仁苷工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)表1所列的試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯绊懣嘈尤受盏寐实闹鞔我蛩貫锳>D>C>B，正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件為A2B2C3D2，即料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度70 ℃。以乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度70 ℃為參數(shù)，在此條件下進(jìn)行超生波輔助提取桃仁中苦杏仁苷的試驗(yàn)，苦杏仁苷得率最高可以達(dá)到2.88%。

2.4.2? ? 驗(yàn)證性試驗(yàn)。選定工藝參數(shù)乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時(shí)間為30 min、超聲處理溫度70 ℃進(jìn)行3組平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果分別為2.88%、2.89%、2.89%，取平均值為2.89%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.01個(gè)百分點(diǎn)。因此，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

3? ? 結(jié)論

采用超聲輔助提取技術(shù)對(duì)桃仁中苦杏仁苷進(jìn)行提取，通過設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲輔助提取苦杏仁苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)采用平行重復(fù)取平均值的方法，避免了非必要因素的影響而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成偏差。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（34）四因素三水平的正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。分析正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果，確定影響苦杏仁苷得率因素的主次順序，得出超聲輔助提取苦杏仁苷的較優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時(shí)間30 min、超聲處理溫度70 ℃。在較優(yōu)工藝條件下，苦杏仁苷的率最高可以達(dá)到2.88%。最后設(shè)計(jì)驗(yàn)證性試驗(yàn)，以正交試驗(yàn)確定的較優(yōu)的工藝條件為參數(shù)，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，在該工藝條件下，苦杏仁苷得率的平均值為2.89%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.01個(gè)百分點(diǎn)。因此，正交試驗(yàn)所確定的最優(yōu)超聲輔助提取苦杏仁苷的工藝參數(shù)較為準(zhǔn)確，符合要求。

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