陶曉賽，陳志紅,2，謝彩俠,2*，張 娟,2*，龔海燕,2，劉慶普,2，雷敬衛(wèi),2

1河南中醫(yī)藥大學藥學院；2河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心，鄭州 450046

盾葉薯蕷(D.ZingiberensisC.H.Wright)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬植物，俗稱黃姜、火頭根等，根莖中含有薯蕷皂苷、三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷等大量的甾體皂苷類成分[1]，其含量的高低直接影響著藥材質量的優(yōu)劣[2]。盾葉薯蕷為我國特有品種，根莖中含有的薯蕷皂苷元含量為1.1%～16.15%，是合成避孕藥、甾體激素類藥物的重要原料[3]。盾葉薯蕷不僅作為提取原料，還作為治療心腦血管疾病[4]的臨床用藥。盾葉薯蕷作為提取薯蕷皂苷元重要的藥源植物和治療心腦血管疾病的臨床用藥極大促進了盾葉薯蕷相關產業(yè)的發(fā)展。

由于藥材需求量大，目前盾葉薯蕷已實現(xiàn)了大面積栽培，全國河南、湖南、湖北、陜西、甘肅等10多個省市60多個縣市在發(fā)展盾葉薯蕷產業(yè)，基地面積已逾10多萬公頃[5]。盾葉薯蕷為多年生藥材，產地較多，研究發(fā)現(xiàn)生長環(huán)境及栽培年限對盾葉薯蕷藥材的質量影響較大[6]，但關于不同產地盾葉薯蕷皂苷類成分的評價研究鮮有報道。另外，盾葉薯蕷中皂苷類成分的含量測定目前多采用HPLC法[7-9]，該方法分析過程中樣品前處理較為復雜，分析時間較長、試劑用量較大，檢測成本較高，不能實現(xiàn)盾葉薯蕷皂苷類成分的批量快速檢測，因此，在盾葉薯蕷藥材的收購過程中很難實現(xiàn)按質論價。NIRS是一種檢測速度較快、操作簡便、低消耗、綠色環(huán)保的分析方法，已廣泛應用于中藥材的質量控制中[10-12]?；诖耍狙芯渴紫冉⒘送瑫r測定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷、三角葉薯蕷皂苷及盾葉新苷的HPLC-ELSD方法，然后對全國不同產地盾葉薯蕷中三種甾體皂苷的含量進行測定，同時結合NIRS技術建立快速評價盾葉薯蕷中三種皂苷含量的方法，為盾葉薯蕷藥材的質量評價及收購過程中實現(xiàn)“按質論價”提供科學方法。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國 Thermo 公司)；1200型HPLC儀(美國 Agilent 公司)；ELSD 2000 ES型蒸發(fā)光散射檢測器(德國 Alltech 公司)；KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FW-100型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；101-3AB型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；予華牌循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Milli-Q Reference 純水機(上海和泰儀器有限公司)；CPA225D 型 十萬分之一電子天平；萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試劑

乙腈(色譜純)(TEDIA公司)；甲醇(分析純)(天津市富宇精細化工有限公司)；無水乙醇(分析純)(天津市致遠化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純)(TEDIA公司)；娃哈哈飲用純凈水(濟南娃哈哈恒楓飲料有限公司)；三角葉薯蕷皂苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，生產批號：CHB17051，純度：HPLC≥98%)；盾葉新苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，生產批號：CHB170718，純度：HPLC≥98%)；薯蕷皂苷(成都曼思特生物科技有限公司，生產批號：MUST-17090203，純度：HPLC≥98.78%)。所有對照品均符合含量測定要求。

1.3 樣品

實驗用樣品分別從陜西安康市、陜西商洛市、湖北十堰市、湖北丹江口、湖南懷化沙灣鄉(xiāng)、甘肅隴南、湖北宜昌市、河南南陽市采集盾葉薯蕷藥材共101批，經河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定為盾葉薯蕷(D.zingiberensis)的根莖。去除泥沙等雜質，切片，于鼓風干燥箱中55 ℃烘干至恒重，粉碎后過65目藥典篩，置于干燥器內備用。樣品信息見表 1。

表1 盾葉薯蕷樣品信息

2 方法與結果

2.1 不同產地盾葉薯蕷中三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷及薯蕷皂苷的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為C18(4.6 ×250 mm，5 μm)；以乙腈：水(60∶40)為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為2 μL。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)參數(shù)：氣體流量2.5 L/min，漂移管溫度115 ℃，增益值為2。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱定三角葉薯蕷皂苷1.38 mg、盾葉新苷1.93 mg、薯蕷皂苷1.69 mg，分別置于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，制備濃度分別為0.276、0.386、0.338 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取約2.0 g盾葉薯蕷根莖粉末，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入80%乙醇溶液50 mL，稱重，85 ℃加熱回流提取40 min，放冷，補足失重；搖勻，過濾，精密移取15 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，濃縮至近干，殘渣用甲醇溶解，轉移并定容至5 mL容量瓶，搖勻、濾過，即得。

2.1.4 線性關系考察

用“2.1.2”項下制備的對照品溶液，將三角葉薯蕷皂苷對照品分別制成0.027 6、0.069、0.138 、0.276、0.345、0.414 mg/mL的梯度濃度；盾葉新苷對照品分別制成0.193、0.386、0.965、1.54 4、1.93 0、2.31 6 mg/mL的梯度濃度；薯蕷皂苷分別制成0.067 6、0.101 4、0.135 2、0.338、0.507、0.845 mg/mL的梯度濃度；按照“2.1.1”項下的色譜條件，分別進樣測定三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷及薯蕷皂苷的峰面積，以峰面積積分值的對數(shù)值為縱坐標(Y)，以對照品濃度的對數(shù)值為橫坐標(X進行線性回歸，并繪制標準曲線，結果如表2所示。

表2 線性關系考察

2.1.5 精密度考察

精密吸取對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷的峰面積RSD值分別為2.2%、2.7%、2.9%。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察

將同一供試品溶液分別在樣品制備后0、4、8、12、24 h按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，結果三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷的峰面積RSD值分別為2.3%、2.7%、2.7%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性考察

精密稱取同一批宜昌樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算含量。結果三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷含量的RSD值分別為2.4%、0.5%、2.8%，說明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率考察

稱取南陽2年生樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中并精密加入適量三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算平均加樣回收率及RSD，結果見表3、4、5。由表3、表4、表5可知，三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷的平均回收率分別為99.80%、101.4%、99.30%，RSD分別為0.3%、0.6%、1.3%。

表3 三角葉薯蕷皂苷加樣回收率考察結果

表4 盾葉新苷加樣回收率考察結果

2.1.9 樣品含量測定

取各樣品按“2.1.3”項下制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件分別測定101盾葉薯蕷樣品中三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷和薯蕷皂苷的含量，對照品及樣品HPLC色譜圖見圖1，含量測定結果見表6。

圖1 盾葉薯蕷樣品(A)和對照品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of D.zingiberensis sample ( A) and reference substance ( B )注：1.盾葉新苷；2.三角葉薯蕷皂苷；3.薯蕷皂苷。Note:1.Zingiberensis newsaponin;2.Deltonin;3.Dioscin.

表6 101份盾葉薯蕷樣品中三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷、薯蕷皂苷含量測定結果

續(xù)表6(Continued Tab.6)

樣品編號No.三角葉薯蕷皂苷Deltonin盾葉新苷Zingiberensis newsaponin薯蕷皂苷Dioscin樣品編號No.三角葉薯蕷皂苷Deltonin盾葉新苷Zingiberensis newsaponin薯蕷皂苷DioscinS240.8970.7850.074S751.71 90.7190.119S250.5030.5050.031S760.5120.6220.109S260.2900.5910.072S770.4000.5140.118S270.4610.5810.116S780.3560.8720.056S280.3190.3930.086S790.3980.5290.065S290.4000.5070.102S800.4010.6390.080S300.4100.5300.103S810.5450.4370.069S310.4600.5220.110S820.5980.6900.109S320.4480.5220.109S830.4130.4010.054S330.3890.5940.080S840.4600.6640.088S340.2900.5310.072S850.4290.6830.110S350.3160.5620.099S860.3430.7450.095S360.4140.5660.111S870.2740.6840.070S370.5060.7030.122S880.3180.7260.083S380.4730.7140.097S890.3020.8340.130S390.6300.7030.093S900.2630.8170.107S400.5970.6970.116S910.4590.5250.080S410.7050.6670.116S920.3660.8770.138S420.7030.7990.137S930.3630.7900.141S431.03 90.9080.129S940.3771.02 30.136S440.5180.6440.093S950.3720.9580.136S451.08 60.8120.116S960.3360.9120.114S460.5630.5890.109S970.8340.8940.060S471.22 80.6620.104S980.4760.7090.047S481.06 80.6930.117S990.5421.00 40.033S491.23 90.7410.109S1000.5530.9390.051S500.9200.6610.099S1010.3950.7570.047S510.7100.8100.150

2.2 盾葉薯蕷樣品NIR的采集

分別取盾葉薯蕷樣品粉末適量平鋪于近紅外光譜石英樣品杯中，采用積分球漫反射法，在分辨率8 cm-1、掃描次數(shù)64、掃描范圍12 000～4 000 cm-1、溫度25 ℃、濕度28%的采集條件下，掃描101份盾葉薯蕷樣品的NIR，每份樣品重復采集3次，取其平均光譜(見圖2)。

2.3 三角葉薯蕷皂苷NIR定量分析模型的建立

首先，根據(jù)101份盾葉薯蕷樣品中三角葉薯蕷皂苷的HPLC含量測定結果，將特異值和含量接近的樣品剔除，保留三角葉薯蕷皂苷模型建立所用的有效樣品。按照校正集與驗證集樣品比例約4∶1及驗證集樣品含量范圍在校正集樣品含量范圍內的原則從有效樣品中選擇模型建立所用的校正集樣品和模型驗證所需的驗證集樣品。然后，將盾葉薯蕷校正集樣品中三角葉薯蕷皂苷的HPLC含量測定結果作為參考值分別輸入TQ Analyst 8.0分析軟件，結合校正集樣品的NIR，利用偏最小二乘法(PLS)，以R2、RMSEC、RMSEP及PI為評價指標，考察光譜預處理方法、光譜范圍以及主因子數(shù)等對所建模型性能的影響，其中R2越接近1，RMSEP和RMSEC 值越接近于0、PI值越接近于100的模型適用性越強，預測結果越準確。最后，用所建模型預測驗證集樣品的三角葉薯蕷皂苷含量，以預測值與參考值的平均相對偏差和t檢驗結果，驗證所建模型的推廣能力和預測能力。

圖2 101份盾葉薯蕷樣品的NIR疊加圖Fig.2 NIR overlay maps of 101 samples of D.zingiberensis

2.3.1 校正集與驗證集的選擇

通過分析盾葉薯蕷樣品中三角葉薯蕷皂苷含量的分布特點及校正集與驗證集樣品的選擇原則，最終確定98份樣品用于其定量模型的建立及驗證，其中78份為校正集，20份為驗證集。校正集樣品三角葉薯蕷皂苷的含量分布范圍為0.209%～1.975%，平均值1.092%；驗證集0.290%～1.177%，平均值0.734%。

2.3.2 光譜預處理方法的選擇

不同產地及年限的盾葉薯蕷樣品由于顏色、表面紋理、密度等物理性質的差異，會干擾其近紅外光譜中與樣品化學成分相關的光譜信息，而合適的光譜預處理方法可以有效消除物理因素的干擾，提高NIR與待測化學成分的相關性。本研究考察了不同光譜預處理方法對模型性能的影響(見表7)。綜合分析表7中不同光譜預處理方法的R2、RMSEC、RMSEP和PI值，選擇SNV+SD為建立三角葉薯蕷皂苷定量分析模型的最佳光譜預處理方法，原始光譜經最佳光譜預處理方法后所得的近紅外光譜見圖 3。

2.3.3 建模波段范圍的選擇

合適的建模波段可以避免冗余信息對有效光譜信息的干擾，提高所建模型的預測準確性。不同建模波段下模型的性能結果(見表8)顯示，在9 036.80～5 186.92 cm-1的波段范圍內，所建三角葉薯蕷皂苷的定量分析模型整體性能較好。

表7 不同光譜預處理方法對三角葉薯蕷皂苷定量分析模型性能的影響

注：MSC：多元散射校正，F(xiàn)D：一階導數(shù)，SD：二階導數(shù)，SG：濾波法，ND：直接差分法

Note:MSC:Multiplicative signal correction,FD:First derivative,SD:Second derivative,SG:Savitzky-Golay fillter,ND:Norris derivative filter

圖3 Constant+FD預處理后近紅外光譜圖Fig.3 Near infrared spectrum of Constant+FD after pretreatment

表8 不同的光譜范圍對三角葉薯蕷皂苷模型性能的影響

2.3.4 主因子數(shù)的選擇

主因子數(shù)作為模型建立的重要參數(shù)，其取值的多少直接影響模型的預測性能。主因子數(shù)過多，會將代表噪音的主因子引入模型中，導致計算結果出現(xiàn)“過擬合”的現(xiàn)象，主因子數(shù)過少，則不能完全反映樣品被測組分產生的光譜變化，使模型的預測性能下降[13]。本研究以RMSECV為優(yōu)化參數(shù)，根據(jù)RMSECV值隨主因子數(shù)的變化情況(見圖4)選擇合適的主因子數(shù)。結果顯示，RMSECV最小值所對應的主因子數(shù)為6，且隨著主因子數(shù)的增加，RMSECV值的變化趨于穩(wěn)定，因此，選擇6為建立三角葉薯蕷皂苷定量模型的最佳主因子數(shù)。

2.3.5 三角葉薯蕷皂苷NIR定量分析模型的建立

運用TQ Analyst 8.0分析軟件結合PLS法，分別選擇最優(yōu)的光譜預處理方法、建模波段范圍、最佳主因子數(shù)建立三角葉薯蕷皂苷的NIR定量分析模型，三角葉薯蕷皂苷模型的NIR 預測值與 HPLC 參考值的相關圖及偏差見圖 5。結果表明該模型的R2為0.981 1、RMSEC為0.086 3、RMSEP為0.063 8、RMSECV為0.320 26、PI為90.5，模型性能較好。

圖4 三角葉薯蕷皂苷NIR模型主因子數(shù)對RMSECV 的影響Fig.4 Effects of principal factor numbers of deltonin NIR modle on RMSECV

圖5 三角葉薯蕷皂苷NIR預測值與HPLC參考值的相關圖(A)及偏差圖(B)Fig.5 Correlation chart ( A ) and deviation chart ( B ) between NIR predicted value and HPLC reference value of deltonin

2.3.6 盾葉薯蕷中三角葉薯蕷皂苷定量分析模型的驗證

將20份三角葉薯蕷皂苷驗證集樣品的近紅外光譜圖輸入到所建立的定量分析模型中，將三角葉薯蕷皂苷的預測值與HPLC參考值進行比較(見表9)。結果表明，NIR模型預測的三角葉薯蕷皂苷含量測定結果與常規(guī)HPLC法測定結果接近，預測值和參考值的配對樣本t檢驗結果顯示t= -0.975，P= 0.342 > 0.05，因此，預測值和參考值在統(tǒng)計學上無顯著性差異。該實驗結果表明所建立的模型預測性能較好，可以用于盾葉薯蕷中三角葉薯蕷皂苷的含量測定。

表9 驗證集樣品三角葉薯蕷皂苷NIR預測值與 HPLC參考值的比較

2.4 盾葉新苷、薯蕷皂苷近紅外定量分析模型的建立

根據(jù)盾葉薯蕷樣品中盾葉新苷和薯蕷皂苷的含量分布情況，選擇77份為校正集、18份為驗證集用于盾葉新苷定量校正模型的建立及驗證；選擇72份為校正集、18份為驗證集用于薯蕷皂苷定量校正模型的建立及驗證。按照“2.3”項下三角葉薯蕷皂苷定量模型的建立方法分別對兩個模型建立過程中的光譜預處理方法、建模波段范圍及主因子數(shù)等條件進行優(yōu)化，確定建模條件，并對模型進行驗證。結果表明，在光譜預處理方法為SNV+SD+SG、建模波段為8 147.69～5 320.49 cm-1、主因子數(shù)為7的建模條件下，盾葉新苷定量分析模型的R2、RMSEC、RMSEP、RMSECV及PI分別為：0.982 64、0.042 0、0.027 4、0.141 21、91.1；在光譜預處理方法為MSC+SD、建模波段為9 253.34～5 787.98 cm-1、主因子數(shù)為4的建模條件下，薯蕷皂苷定量分析模型的R2、RMSEC、RMSEP、RMSECV及PI分別為0.943 64、0.009 90、0.005 41、0.024 14、85.8。經驗證，兩個模型的NIR預測值與HPLC參考值的絕對與相對偏差均較小，配對樣本t檢驗結果的P值均大于0.05，說明預測值與參考值在統(tǒng)計學上無顯著性差異，因此所建立的模型可以用于盾葉新苷及薯蕷皂苷的含量測定。盾葉新苷、薯蕷皂苷NIR定量分析模型的RMSECV 值隨主因子數(shù)變化的曲線分別見圖6、圖7，NIR預測值與參考值的比較結果分別見見表10、表11。

圖6 盾葉新苷NIR模型主因子數(shù)對RMSECV的影響Fig.6 Effects of principal factor numbers of zingiberensis newsaponin NIR modle on RMSECV

圖7 薯蕷皂苷NIR模型主因子數(shù)對RMSECV 的影響Fig.7 Effects of principal factor numbers of dioscin NIR model on RMSECV

表10 驗證集樣品盾葉新苷NIR預測值與HPLC參考值的比較

續(xù)表10(Continud Tab.10)

樣品編號No.參考值Reference value預測值Predicted value絕對偏差Absolute deviation相對偏差Relative deviationPS740.4960.480-0.016-0.032S800.6390.636-0.003-0.005S840.6640.6990.0350.053S960.9120.9460.0340.037S970.8940.9200.0260.029S1000.9390.911-0.028-0.030

表11 薯蕷皂苷NIR模型預測值與參考值的比較

3 討論

藥用植物次生代謝產物含量的高低從某種意義上來說是其種質與生態(tài)環(huán)境雙重作用的結果[14]。盾葉薯蕷是一種藥效成分比較明確的藥用植物，喜溫暖，不耐嚴寒。根據(jù)中國薯蕷屬植物資源調查資料，盾葉薯預適宜生長于海拔100～1 500 m的河谷、山地、落葉闊葉混交林的邊緣或稀疏的常綠灌木林內[15]，而生態(tài)環(huán)境對盾葉薯蕷形態(tài)性狀與有效成分積累等方面影響較大。Li等[16]研究認為，盾葉薯蕷皂苷類成分的含量與居群環(huán)境存在一定的相關性，其中最主要的影響因素可能是海拔高度。本研究利用HPLC-ELSD法對全國主要產地盾葉薯蕷中三種皂苷類成分的含量進行分析，結果表明，不同產地樣品中的3種甾體皂苷含量差別較大，其中陜西安康產盾葉薯蕷中三角葉薯蕷皂苷和盾葉新苷含量較高，湖南懷化產的薯蕷皂苷含量較高。雖然三種皂苷均屬于甾體皂苷類成分，但其含量的變化規(guī)律并不一致，這可能是由于不同甾體皂苷生物合成途徑中的關鍵酶基因存在差異，而且相同關鍵酶基因的表達受生態(tài)環(huán)境的影響較大。

NIRS是一種利用化學計量學軟件從樣品復雜的近紅外光譜圖中提取和樣品待測性質相關的信息，建立圖譜特征與待測性質之間關系的數(shù)學模型以實現(xiàn)快速預測樣品特征的技術，它對樣品的處理過程要求比較簡單，因此可以在較短的時間內對樣品的性狀及質量做出初步的綜合評價，是一種快速、無損的綠色分析方法。該方法的預測準確性取決于樣品數(shù)量、待測性質的特征及待測性質參考值的測定準確性，其中樣品的數(shù)量及代表性是決定所建模型預測性能好壞的前提。如果要對樣品中某一化學成分的含量進行預測，則要求此化學成分具有較高的含量。本研究采集的盾葉薯蕷樣品涵蓋全國8個產地及不同的生長年限，具有一定的代表性，而且含量測定結果表明三種甾體皂苷的含量均相對較高，因此，可以利用近紅外光譜法進行快速測定。經過基礎數(shù)據(jù)的測定、建模條件的優(yōu)選，本研究建立了可以相對快速、準確預測盾葉薯蕷根莖中三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷及薯蕷皂苷含量的近紅外地定量分析模型，為盾葉薯蕷的質量快速評價提供一種可參考的方法，為盾葉薯蕷實現(xiàn)按質論價收購提供可能。