古裕鳥 霍開明 莊秀娟 蔣家敏 吳小紅 黃旭芳

海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院兒科（海南?？?570311）

新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是指原發(fā)性或繼發(fā)性肺泡表面活性物質減少導致的呼吸系統(tǒng)疾病，其病情進展快、病死率較高，是一種嚴重威脅新生兒生命的呼吸危重癥[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類新型的基因調控分子，可通過影響靶基因的表達而調控炎癥通路和免疫反應，在急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發(fā)病過程中起重要作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c-3p在炎癥性肺疾病中發(fā)生表達變化，參與多個信號通路和各種免疫炎癥反應過程，在ARDS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調控作用[3-4]。然而，miR-200c-3p在NRDS中的表達及其臨床意義尚未有報道。本研究通過檢測ARDS新生兒血清miR-200c-3p表達水平，分析其對NRDS預后評估的價值，旨在為NRDS救治提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性選取2016 年6 月至2019 年6 月海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的NRDS新生兒。納入標準：①符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒(2017年版)》診斷標準[5]；②經(jīng)影像學檢查（X 線胸片顯示雙肺彌漫性陰影伴肺水腫改變，超聲心動圖檢查無左心房高壓表現(xiàn)），并結合臨床癥狀及體征確診；③急性起病，重癥監(jiān)護室機械通氣時間≥72小時，胎齡＞32周。排除標準：①肺外嚴重感染；②原發(fā)性肺泡表面活性物質缺乏、先天性心臟病、先天性代謝紊亂；③肺和胸壁畸形及其他嚴重的先天畸形。

以新生兒診斷為NRDS為研究起點，痊愈出院或死亡作為研究終點，將其分為生存組（治愈和病情好轉出院）和死亡組（病情危重放棄治療和死亡）。患兒依據(jù)入院24 小時內首次胸片結果及病情嚴重程度分為輕度組（Ⅰ、Ⅱ級）和重度組（Ⅲ、Ⅳ級）。所有患兒均有新生兒ARDS特征性的X 線表現(xiàn)。Ⅰ級：兩肺野透亮度明顯降低，可見均勻散在的細小顆粒和網(wǎng)狀陰影；Ⅱ級：除Ⅰ級變化加重外，可見支氣管充氣征，延伸至肺野中外帶；Ⅲ級：病變加重，肺野透亮度更加降低，心緣、膈面模糊；Ⅳ級：整個肺野呈白肺，支氣管充氣征更加明顯，似禿葉樹枝。所有患兒確診后12 小時內應用新生兒急性生理學評分圍生期補充II（Perinatal Supplement of Acute Physiological Score for Neonates II，SNAPPE-II）進行評分，評分范圍0～162分，分值越高，病情越重。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 記錄患兒入院時的胎齡、性別、出生體質量、病因及母親的基本情況。

1.2.2 miR-200c-3p檢測 所有患兒于確診次日采集空腹靜脈血5 mL置未加抗凝劑的離心管中，離心分離血清（離心力2 054×g、離心時間10 min），-80℃低溫冰箱保存。應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉錄已定量的RNA，選用U 6 作為內參。反應體系為15 μL：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸（dNTPs），1.00 μL逆轉錄酶（50 U/μL），10×反轉錄緩沖液1.50 μL，0.19 μL RNase抑制劑（20 U/μL），4.16 μL無菌三蒸水。反應參數(shù)：16℃反應30 min，42℃反應30 min，85℃反應5 min，4℃恒溫放置保存，每個反應均為1個循環(huán)。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應。反應體系為20 μL：1 μL 引物及探針Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液，1.33 μL反轉錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μL無核酸酶的水。擴增條件：95 ℃預變性10 min 1個循環(huán)，95 ℃變性15 s、60 ℃復性60 s進行45個循環(huán)，實驗重復3次。采用2-ΔΔCt法計算miR-200c-3p的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-200c-3p表達水平及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS死亡的價值，曲線下面積（area under cure，AUC）比較采用Z檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患兒基本情況

102例NRDS患兒胎齡32～41周，中位胎齡37.0周；出生體質量2 690 g（2 560～2 920）g；足月兒46例，早產(chǎn)兒56例。46例足月兒中男29例、女17例，胎齡37～41周，中位胎齡39.5周，出生體質量2 862 g（2 685～3 170）g；56例早產(chǎn)兒中男35例、女21例，胎齡32～37周，中位胎齡34.80周，出生體質量2 530 g（2 382～2 610）g。

2.2 死亡組和生存組一般資料比較

死亡組和生存組性別比、胎齡、出生體質量、病因構成、母親年齡以及雙胎、剖宮產(chǎn)及羊水異常比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2 .3 死亡組和生存組miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評分比較

死亡組血清miR-200 c-3p 表達水平及SNAPPE-Ⅱ評分均明顯高于生存組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 重度組和輕度組miR-200 c-3p 表達水平及SNAPPE-Ⅱ評分比較

重度組血清miR-200c-3p 表達水平及SNAPPE-Ⅱ評分、病死率均明顯高于輕度組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.5 血清miR-200 c-3p 及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS死亡的價值

血清miR-200c-3p表達水平及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS 患兒死亡的最佳截值分別為0.52、23.60分。miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS患兒死亡的AUC為0.93（95%CI：0.87～0.98），明顯高于單項miR-200c-3p（0.84，95%CI：0.78～0.90）及SNAPPE-Ⅱ評分（0.80，95%CI：0.75～0.86），差異有統(tǒng)計學意義（Z=5.32、5.87，P均＜0.05），其靈敏度和特異度為94.0%和88.5%。見表3、圖1。

2.6 血清miR-200c-3p水平與SNAPPE-Ⅱ評分相關性分析

Pearson 相關分析顯示，NRDS 患兒血清miR-200 c-3p 表達水平與SNAPPE-Ⅱ評分呈顯著正相關（r=0.84，P＜0.001）。

表1 死亡組和生存組臨床資料比較

圖1 miR-200c-3p 水平及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS 死亡ROC 曲線

表2 重度和輕度組miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評分比較

3 討論

目前NRDS缺乏特效治療手段，仍是以呼吸支持、肺表面活性物質替代、體外膜肺氧合、營養(yǎng)支持及液體管理等對癥及綜合治療為主，治療難度較大，病死率仍然較高。因此，如何早期預測NRDS的預后，進而針對其進行綜合治療，對提高患兒的預后及降低病死率具有重要意義。miRNA是一類由18～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，通過miRNA 剪切和抑制蛋白質翻譯的方式參與靶基因的轉錄后調控，在細胞的分化、增殖、凋亡、血管生成以及炎癥免疫反應中發(fā)揮重要作用[6-7]。相關研究表明，miRNA 參與了ARDS的發(fā)生、發(fā)展，在ARDS 炎癥反應和細胞凋亡中起重要的調控作用，有望成為ARDS的新型生物標志物和治療新靶點[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ARDS中發(fā)生表達變化，miRNA 參與上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞的病理生理過程，決定了ARDS患者的病程進展和預后[9]。SNAPPE-Ⅱ評分是一種應用較廣的新生兒危重病例評分系統(tǒng)，對新生兒危重癥有良好預測價值，能準確地預測多種新生兒危重疾病的預后[10]。

表3 miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS死亡的價值

本研究顯示，死亡組血清miR-200 c-3p 表達水平及SNAPPE-II評分均明顯高于生存組，重度組血清miR-200c-3p表達水平、SNAPPE-II評分及病死率均明顯高于輕度組，提示血清miR-200c-3p表達水平及SNAPPE-II評分與NRDS的病情嚴重程度有關，miR-200c-3p表達水平高的RDS新生兒預后較差，發(fā)生死亡的風險較高。相關研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA表達水平在NRDS中明顯升高，且與NRDS病情嚴重程度和預后密切相關[11]。另有研究表明，采用SNAPPE-II評分對RDS患兒預后進行評估，可預測其死亡的發(fā)生風險，SNAPPE-II評分越高，RDS患兒的死亡風險越大[12]。本研究相關分析顯示，NRDS患兒血清miR-200c-3p表達水平與SNAPPE-II評分呈正相關，進一步說明血清miR-200 c-3p 表達水平與NRDS 的病情嚴重程度密切相關。本研究應用ROC曲線分析結果顯示，血清miR-200c-3p表達水平及SNAPPE-II評分預測NRDS死亡的最佳截值分別為0.52、23.60分，miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-II評分預測NRDS死亡的AUC最大，其靈敏度和特異度較好。相關研究認為，miRNA通過作用于靶mRNA，調節(jié)基因表達，參與肺的發(fā)育及損傷修復過程，并在NRDS中發(fā)生差異表達，可作為NRDS的潛在治療靶點[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200 c-3p 與NRDS 的疾病發(fā)展和嚴重性有關，可作為NRDS 預后評估的生物標志物，同時也為臨床治療NRDS 提供新的思路[14]。另有研究表明，SNAPPE-II 評分越高，NRDS死亡風險越大，早期進行SNAPPE-II評分評估，有利于預測NRDS病情危重程度及預后情況，對改善患兒預后具有重要意義[15]。

綜上所述，血清miR-200 c-3p 表達水平升高與NRDS病情嚴重程度及預后相關，miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-II評分對NRDS 預后判斷具有較高的價值，miR-200c-3p有望作為NRDS潛在的預后標志物和治療新靶點。但這些研究仍處于初步階段，今后尚需更多的臨床研究進一步證實miR-200c-3p在NRDS中的應用價值，使之成為診療NRDS的新途徑。