陳 越 李虎林 朱詩(shī)苗 閆 寒 郎 彬 姬文秀

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，133002，吉林延吉）

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是植物生長(zhǎng)素的一種，是植物生長(zhǎng)過程中分泌的調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì)[1]，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞的體積和質(zhì)量增加，還具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化、調(diào)節(jié)生根等生理功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中約有一半的細(xì)菌能夠合成IAA[3]，而這些細(xì)菌常見于植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizabacteria，PGPR）。PGPR泛指生存于植物根際土壤或定植于植物根表、根內(nèi)的一類對(duì)植物生長(zhǎng)有益的微生物[4]，可通過固氮、溶磷解鉀、產(chǎn)生植物激素等途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5]。徐立國(guó)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，菌株3183貝萊斯茅芽孢桿菌（Bacillus velezensis）具有高產(chǎn)IAA能力，用其澆灌后的煙草地上部和地下部鮮重均高于對(duì)照。邢芳芳等[7]研究表明，菌株HB-1枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有較好的IAA生產(chǎn)能力，且對(duì)白菜生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用。汪錢龍等[8]研究結(jié)果顯示，菌株C-3解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）生長(zhǎng)素分泌能力最強(qiáng)，可明顯提高玉米鮮重、干重、株高等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。有報(bào)道稱，促生菌Variovorax boronicumulansCGMCC 4969具有被寄主植物用來調(diào)節(jié)IAA水平的潛力[9]。此外，優(yōu)化微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件，可使菌株獲得最大量的目標(biāo)代謝產(chǎn)物。王呈玉等[10]優(yōu)化XSF巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）促生菌劑發(fā)酵工藝條件，使其活菌數(shù)達(dá)到2.56×1010cfu/g。王勇等[11]優(yōu)化促生菌株Bacillus amyloliquefaciensGZ-5發(fā)酵條件后，其菌體生物量及芽孢生成量均達(dá)到最佳。因此，對(duì)具有分泌IAA能力的植物根際促生菌的研究逐步成為微生物肥料研究的熱點(diǎn)，而篩選具有產(chǎn)生IAA的微生物可為促生生物肥料的研發(fā)等提供菌株。

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物生理生化實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)延邊不同煙區(qū)、不同煙草品種內(nèi)生及根際細(xì)菌群落進(jìn)行了全面的分析，獲得了多種原位細(xì)菌資源[12]。本試驗(yàn)擬進(jìn)一步分離篩選具有產(chǎn)IAA能力的促生菌株，明確其分類地位，并采用液體搖瓶發(fā)酵單因素試驗(yàn)優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，研究單細(xì)菌及混合菌劑對(duì)煙草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為煙草促生生物菌劑的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 延邊地區(qū)煙草根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用于菌株液體培養(yǎng)；LA培養(yǎng)基：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、瓊脂粉15g，用于菌株固體培養(yǎng)；Salkowski試劑：35%高氯酸500mL、0.5mol/L FeCl310mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）；其他試劑：1% CuSO4、0.5% ZnSO4、L-色氨酸、標(biāo)準(zhǔn)吲哚乙酸（IAA），以上生化試劑均為分析純。細(xì)菌DNA提取及擴(kuò)增試劑均為分析純，Taq酶、dNTP、Buffer Mg(-)、MgCl2等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。細(xì)菌通用引物27f和1492r由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 煙草種子 供試煙草品種為吉煙9號(hào)，由延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院煙草研究所提供種子。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離 于2017年6月在吉林省延邊煙草種植區(qū)采集樣本，采用五點(diǎn)取樣法選取健康煙株，輕輕抖落附著的土壤，截取煙株根部放置于自封袋中，裝入冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。小心取出煙根，將其置于500mL容量瓶中，加入200mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.8），恒溫?fù)u床200轉(zhuǎn)/min振蕩20min后，將洗脫的土壤混懸液離心，棄上清液，所得沉淀即為根際土樣品。將1g煙草根際土壤放入無菌三角瓶中，加入9mL生理鹽水震蕩20min，靜置5min，待土壤均勻分散開，按10倍遞減稀釋法稀釋后于LA培養(yǎng)基上涂布。細(xì)菌分離純化后，挑取單菌株置于30%甘油中，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)IAA菌株的篩選 定性初篩：向滅菌后的LB液體培養(yǎng)基加入100mg/L L-色氨酸，接入供試菌株180轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)2d，4 000轉(zhuǎn)/min離心10min，吸取2mL上清液，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，觀察其顏色變化，以50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)IAA作對(duì)照，變粉紅色為具有產(chǎn)IAA能力的菌株。

定量復(fù)篩：將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h后，在600nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)下調(diào)節(jié)OD600值為0.8后備用。將菌株發(fā)酵液4 000轉(zhuǎn)/min離心10min，吸取3mL上清液，加入等體積Salkowski比色液，重復(fù)3次，靜置30min后測(cè)定530nm處的吸光值，以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以IAA濃度為橫坐標(biāo)、OD530為縱坐標(biāo)制作IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA產(chǎn)量[13-14]。

1.2.3 產(chǎn)IAA菌株的鑒定 采用改進(jìn)的SDS-CTAB方法提取細(xì)菌基因組DNA[15]，選用16S rRNA通用引物27f/1492r，以細(xì)菌DNA為模板，配制25 μ L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增[12]。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)以獲取相似性最高的植株。

1.2.4 菌株間拮抗反應(yīng)測(cè)定 將篩選出的產(chǎn)IAA能力最大的2株菌株m-53和m-60進(jìn)行拮抗反應(yīng)測(cè)試。菌株活化后兩兩相交接種于LB平板上，并在30℃下培養(yǎng)24～48h，觀察接觸部位細(xì)菌生長(zhǎng)情況，若接觸部位細(xì)菌生長(zhǎng)不良或不生長(zhǎng)，則說明這2株菌株之間存在拮抗作用，不宜混合培養(yǎng)；反之，則說明2株菌株之間無抑制作用，可以混合培養(yǎng)。

1.2.5 產(chǎn)IAA菌株培養(yǎng)時(shí)間的確定 采用單因素法，于搖床分別振蕩培養(yǎng)12、24、36、48、60、72和84h，計(jì)算出相應(yīng)的IAA產(chǎn)量，從而確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.6 煙草種子萌發(fā)試驗(yàn) 根據(jù)最佳培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)產(chǎn)IAA菌制備菌懸液，種子經(jīng)1% CuSO4和0.5%ZnSO4溶液分別浸種30和15min，無菌水沖洗3～5次備用。將消毒后的煙草種子在菌懸液中浸泡30min，對(duì)照（CK）為未接菌處理，種子浸泡在無菌液體培養(yǎng)基中。將種子置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，每皿100粒，重復(fù)3次，于26℃光照培養(yǎng)144h，每12h觀察種子萌發(fā)情況，于第7天測(cè)定苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)。計(jì)算發(fā)芽指標(biāo)：發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)（發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，Gt為發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)）、活力指數(shù)（活力指數(shù)=GI×S，GI為發(fā)芽指數(shù)，S為規(guī)定日期內(nèi)幼苗或幼根的長(zhǎng)度或質(zhì)量）。

1.2.7 煙草盆栽育苗試驗(yàn) 將經(jīng)表面消毒后的煙草種子與菌懸液拌種處理，均勻播撒在混有細(xì)砂的滅菌花盆中，以無菌液體培養(yǎng)基拌種作為對(duì)照，出苗后每隔1周灌根1次。出苗后第30天，取10株長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗測(cè)定其株高、莖圍、葉片數(shù)、根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、地上部鮮重和地下部鮮重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010繪制圖表，利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)IAA菌株的篩選與鑒定

經(jīng)定性篩選得到產(chǎn)IAA菌株27株。通過定量測(cè)定（表1），發(fā)現(xiàn)菌株m-53與m-60產(chǎn)IAA量超過40.00mg/L，故挑選這2株菌株進(jìn)行下一步研究，其形態(tài)示于圖1；經(jīng)分子鑒定獲得m-53與m-60 16S rRNA的相似性比對(duì)結(jié)果（表2）。

表1 煙草根際細(xì)菌產(chǎn)IAA能力Table 1 The ability of IAA production of rhizosphere bacteria from tobacco mg/L

圖1 m-53和m-60菌株形態(tài)Fig.1 Morphology of m-53 and m-60 strains

表2 細(xì)菌16S rRNA序列與GenBank-BLAST比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison of 16S rRNA sequence and GenBank-BLAST of bacteria

2.2 菌株間的拮抗測(cè)定

菌株間拮抗測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示，m-53與m-60菌株間不發(fā)生拮抗反應(yīng)，即2種菌株可以混合培養(yǎng)。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)IAA含量的影響

由圖3可知，菌株m-53生長(zhǎng)迅速且于培養(yǎng)24h時(shí)OD600達(dá)到最大值；菌株m-60初始生長(zhǎng)緩慢，但于培養(yǎng)48h時(shí)OD600達(dá)到最大值；2株混合培養(yǎng)OD600最大值高于單獨(dú)培養(yǎng)，且于培養(yǎng)60h時(shí)達(dá)到峰值，說明二者具有相互促進(jìn)的作用。

圖2 m-53與m-60菌株間拮抗反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The results of antagonistic reaction between m-53 and m-60 strains

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株及其組合生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effects of culture time on the growth of strain and its combination

由圖4可以看出，在培養(yǎng)24h時(shí)，菌株m-53產(chǎn)IAA最多，且顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間；菌株m-60在培養(yǎng)48h時(shí)產(chǎn)IAA最多；2株混合培養(yǎng)在48h時(shí)IAA產(chǎn)量最高。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株及組合產(chǎn)IAA能力的影響Fig.4 The effects of culture time on IAA production ability of strain and its combination

2.4 產(chǎn)IAA菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響

由表3可知，2種促生菌單獨(dú)施用和混合施用都可以增加吉煙9號(hào)煙草種子的發(fā)芽指標(biāo)。對(duì)于發(fā)芽勢(shì)來說，混合施用顯著高于其他處理，與CK相比增加了30.61%；對(duì)于發(fā)芽率來說，施菌處理高于CK，但無顯著差異；對(duì)于發(fā)芽指數(shù)來說，混合施用效果最佳，且比CK增加19.64%；對(duì)于活力指數(shù)來說，施用m-53與混合施用均顯著高于CK，其中混合施用效果最佳，與CK相比增加25.39%。綜上，2種促生菌均能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)且混合施用比單獨(dú)施用效果更好。

表3 促生菌對(duì)煙草種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Table 3 The effects of bacteria on germination indexes of tobacco seeds

2.5 產(chǎn)IAA菌株對(duì)煙草幼苗農(nóng)藝性狀的影響

由表4和圖5可知，m-53單獨(dú)施用和2種促生菌混合施用對(duì)煙草的株高、根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、莖圍和葉片數(shù)均有促進(jìn)作用，且混合施用的效果最佳，除根長(zhǎng)外，m-60與CK無顯著差異。

表4 促生菌對(duì)煙苗農(nóng)藝性狀的影響Table 4 The effects of bacteria on agronomic traits of tobacco seedlings

圖5 促生菌對(duì)煙苗生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effects of growth-promoting bacteria on the growth of tobacco seedlings

2.6 產(chǎn)IAA菌株對(duì)煙苗生物量的影響

由表5可知，m-53單獨(dú)施用和2種促生菌混合施用對(duì)煙苗生物量均有顯著影響，且混合施用的效果更佳。m-60與CK間根冠干重比差異顯著。與CK相比，混合施用對(duì)煙苗地上部干重和鮮重、地下部干重和鮮重，及干重和鮮重根冠比有顯著增加的作用，地上部鮮重為CK的2.3倍，地上部干重為CK的2.63倍，地下部鮮重為CK的4.31倍，地下部干重為CK的4.57倍。根冠比反映植物地下部與地上部的相關(guān)性，鮮重根冠比相較于CK增加了86.11%，干重根冠比相比于CK增加了68.81%。

表5 促生菌對(duì)煙苗生物量的影響Table 5 The effects of bacteria on biomass of tobacco seedlings

3 討論

IAA作為植物中最重要的生長(zhǎng)素之一，其作用主要有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂、增加并促進(jìn)根的分化及其生物量的增大、維持頂端優(yōu)勢(shì)等。低濃度的IAA促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)；當(dāng)濃度高到一定值時(shí)，會(huì)抑制其促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)的作用。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)PGPR產(chǎn)IAA的研究多集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、固氮菌屬（Azotobacter）等[16-17]，但不同菌株IAA分泌量差異較大。本試驗(yàn)分離篩選產(chǎn)IAA菌株鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacteriumsp.）m-53與咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccussp.）m-60，其產(chǎn)IAA能力分別為43.06和41.37mg/L，略高于吳翔等[18]從煙草根際土壤中分離篩選的Bacillus flextts菌株（28.16mg/L）；與張英等[19]從西藏阿里地區(qū)采集披堿草根系及根際土壤中篩選出的菌株NXP17分泌IAA能力相差不大。

優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件可實(shí)現(xiàn)菌株生產(chǎn)最大化。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定m-53、m-60及二者混合的最佳培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48和48h，其對(duì)應(yīng)的IAA產(chǎn)量分別為98、41和141mg/L。研究表明，菌株的生產(chǎn)發(fā)酵效率與培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件有密切關(guān)系[20]。徐婧等[21]對(duì)產(chǎn)IAA菌株GMZB-12進(jìn)行優(yōu)化后，IAA產(chǎn)量為36.88mg/L，比優(yōu)化前提高7.75mg/L。

生長(zhǎng)素是促進(jìn)不定根形成的主要因素，可以調(diào)控側(cè)根的形成，外源施加生長(zhǎng)素可以激活中柱鞘形成側(cè)根原基[22]。研究表明，PGPR促生效果明顯，能有效提高農(nóng)作物對(duì)土壤中養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化且提高作物的生物量。王婧[23]用濃度為106cfu/mL的橘黃假單胞菌JD37菌液浸種和107cfu/mL的菌液處理幼苗，發(fā)現(xiàn)其對(duì)番茄種子及幼苗均具有一定的促生作用。Zemrany等[24]在試驗(yàn)中通過增施促生菌肥提高玉米鮮重34%。王辰月等[25]研究中也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)IAA細(xì)菌對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)通過研究產(chǎn)IAA促生菌單菌株和混合菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果表明單獨(dú)施用和混合施用菌株均能促進(jìn)種子萌發(fā)，能有效提高煙苗各項(xiàng)農(nóng)藝性狀及生物量，且混合施用菌株優(yōu)于單獨(dú)施用，這與劉青海[26]試驗(yàn)結(jié)果一致。產(chǎn)IAA促生菌一般同時(shí)具有多種促生功能，但菌株m-53與m-60的促生作用機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從延邊煙草根際土壤中篩選出的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacteriumsp.）m-53與咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccussp.）m-60產(chǎn)IAA效果較好，優(yōu)化培養(yǎng)條件后發(fā)現(xiàn)m-53、m-60及二者混合的最佳培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48和48h，其對(duì)應(yīng)的IAA產(chǎn)量分別為98、41和141mg/L。與對(duì)照相比，在種子萌發(fā)及盆栽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單一菌和混合菌劑均能促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，尤以混合菌劑效果最佳。