王琳 徐萍 王靜 田軍 謝曉嵐

1南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院，上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200090；2復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200540

AP是臨床常見急腹癥，其發(fā)病急，進(jìn)展快，若不及時治療則可能發(fā)展為SAP，甚至并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[1-2]，最終導(dǎo)致患者死亡。以巨噬細(xì)胞為主的多種免疫細(xì)胞參與胰腺炎炎癥的起始、發(fā)展等各個階段。巨噬細(xì)胞在疾病發(fā)展的不同階段因所處微環(huán)境的不同而發(fā)生表型的變化并表現(xiàn)出不同的功能，這一過程稱為巨噬細(xì)胞極化。胰腺炎時，單核巨噬系統(tǒng)被激活，大量巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化，釋放大量促炎細(xì)胞因子促進(jìn)胰腺炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞，其免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)功能在多種疾病中發(fā)揮治療作用[4-5]。體外實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用與巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。本研究通過尾靜脈注射BMSCs，觀察BMSCs對ANP大鼠炎癥反應(yīng)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及分組

Sprague Dawley雄性大鼠30只，SPF級，鼠齡2.0～2.5個月，體重220～250 g，購于上海捷思杰實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號為SCKK(滬)2013-0006。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組，ANP組，低、中、高劑量BMSCs治療組，每組6只。

制模前15 min經(jīng)腹腔注射0.8%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，采用胰膽管逆行注入5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg的方法制備ANP模型。低、中、高劑量BMSCs治療組在制模后1 h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射0.5×106、1×106、3×106個BMSCs，BMSCs購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。對照組僅經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。ANP組在制膜后1 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。制模后12 h，先抽取腹水，計(jì)量，然后以20 ml預(yù)冷PBS行腹腔灌洗，收集灌洗液，并重復(fù)灌洗收集1次；抽取大鼠外周靜脈血；分離胰腺組織。

二、方法

1．血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測：外周靜脈血離心，收集上層血清，-80℃保存。采用胰淀粉酶檢測試紙(干化學(xué)法)檢測血清淀粉酶水平。采用ELISA法分別檢測血清TNF-α、IL-1β、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平。TNF-α、IL-1β試劑盒購自美國BioScience公司，MPO試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，按試劑盒說明書操作。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、精氨酸酶1(anginase1,Arg1)蛋白檢測：胰腺組織經(jīng)4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色。采用免疫組織化學(xué)染色檢測胰腺iNOS、Arg1蛋白的表達(dá)。iNOS抗體、Arg1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。由病理科醫(yī)師盲法閱片，每張切片隨機(jī)選擇8～10個高倍視野，采用Schmidt法從水腫、腺泡和脂肪壞死、出血、炎癥細(xì)胞浸潤4個方面進(jìn)行病理評分[6]。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色微細(xì)顆粒為陽性巨噬細(xì)胞。

3．腹腔巨噬細(xì)胞收集及TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)檢測：收集并記錄2次灌洗的腹腔灌洗液，以密度離心法4℃、2 000 g離心15 min，棄上清。離心后若有大量紅細(xì)胞，則加入于紅細(xì)胞2～3倍容積的紅細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物有限公司)吹打，靜置2 min后再次離心棄上清，以DMEM完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素)重懸細(xì)胞，均勻接種于12孔板或10 cm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)4 h。待巨噬細(xì)胞貼壁后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收集巨噬細(xì)胞。應(yīng)用Trizol抽提巨噬細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR法檢測腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)量。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。TNF-α正向引物序列5′-GCATGATCCGAGATGTGGAACTGG-3′，反向引物序列5′-CGCCACGAGCAGGAATGAGAAG-3′；iNOS正向引物序列5′-GAGACGCACAGGCAGAGGTTG-3′，反向引物序列5′-CAGGAAGGCAGCAGGCACAC-3′；以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參。所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，△Ct值=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct值=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對照組，以公式2-△△Ct計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

4．腹腔M1(F4/80+CCR2+)型、M2(F4/80+CD163+)型巨噬細(xì)胞亞群表型檢測：收集上述10 cm培養(yǎng)皿中巨噬細(xì)胞，離心，PBS重懸后再次離心，按照F4/80-FITC、CCR2-PE、CD163-APC抗體說明書加入適量抗體(均購自北京博奧森生物工程有限公司)，室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠腹水量、血淀粉酶水平和胰腺組織病理變化

制模后12 h，ANP組大鼠腹水量、血淀粉酶水平均顯著高于對照組，各治療組大鼠腹水量均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。各治療組大鼠血淀粉酶水平與ANP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組之間腹水量和血淀粉酶水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡細(xì)胞排列整齊，腺泡小葉結(jié)構(gòu)完整。ANP組大鼠胰腺組織可見明顯腺泡細(xì)胞變性、壞死，小葉結(jié)構(gòu)大部分破壞，小葉間隔增大，間隙水腫，紅細(xì)胞和炎細(xì)胞大量浸潤，病理評分顯著高于對照組。各治療組大鼠胰腺組織損傷明顯減輕，表現(xiàn)為小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，變性、壞死減輕，炎細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤減少(圖1)，病理評分均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組間胰腺病理評分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中中劑量治療組胰腺病理評分顯著低于低、高劑量治療組(表1)。

免疫組織化學(xué)染色見ANP組大鼠胰腺組織內(nèi)有較多iNOS、Arg1陽性巨噬細(xì)胞，對照組及各治療組無陽性細(xì)胞或有少量陽性巨噬細(xì)胞(圖2)。

二、各組大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MPO水平

制模后12 h，ANP組大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MPO水平均顯著高于對照組，各治療組血TNF-α、IL-1β、MPO水平均顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。各治療組間血TNF-α、IL-1β、MPO水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中中劑量治療組血TNF-α、IL-1β、MPO水平顯著低于低、高劑量治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。

組別 只數(shù)腹水量(ml)血淀粉酶(U/L)胰腺病理評分對照組 60.83±0.52865.00±167.190ANP組 66.67±2.34a12820.00±4973.10a14.00±1.55a低劑量治療組64.17±0.98ab9886.67±2466.53a 6.50±1.04abc中劑量治療組64.17±1.17ab12643.33±5981.88a4.67±0.82ab高劑量治療組64.33±1.21ab11133.33±2815.18a 8.83±0.75abc

注：ANP為急性壞死性胰腺炎。與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01；與中劑量治療組比較，cP<0.05

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖1對照組(1A)、ANP組(1B)、高劑量治療組(1C)、中劑量治療組(1D)、低劑量治療組(1E)胰腺病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

圖2 對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠胰腺組織iNOS陽性(2A、2B、2C)及Arg1陽性巨噬細(xì)胞(2D、2E、2F)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

表2 5組大鼠血TNF-α、IL-1β和MPO水平

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α；IL-1β為白介素1β；MPO為髓過氧化物酶；ANP為急性壞死性胰腺炎。與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01；與中劑量治療組比較，cP<0.05

三、各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)

制模后12 h，對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量分別為1、6.53±3.45、2.16±0.98；iNOS mRNA表達(dá)量分別為1、7.37±2.98、2.32±1.88，ANP組顯著高于對照組，中劑量治療組顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

四、各組大鼠腹腔M1型、M2型巨噬細(xì)胞亞群比值比較

對照組、ANP組、中劑量治療組大鼠F4/80+CCR2+M1型巨噬細(xì)胞與F4/80+CD163+M2型巨噬細(xì)胞比值分別為1.12±0.03、2.02±0.31、1.53±0.10，ANP組顯著高于對照組，中劑量治療組顯著低于ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。

討 論

巨噬細(xì)胞作為重要的先天和后天免疫細(xì)胞，其不同表型之間相互協(xié)調(diào)與穩(wěn)定是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的必要條件，任何亞型的失衡都可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展[7]。巨噬細(xì)胞根據(jù)所處微環(huán)境的不同可極化為促炎M1型和免疫調(diào)節(jié)的抑炎M2型。腹腔巨噬細(xì)胞的激活是SAP發(fā)生的早期事件，本課題組前期研究結(jié)果表明，腹腔巨噬細(xì)胞活化參與胰腺炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[8]，因此，通過早期調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化表型，可有效避免M1型巨噬細(xì)胞的過度激活，從而減輕胰腺炎癥狀。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎圖3 對照組(3A、3B)、ANP組(3C、3D)、中劑量治療組(3E、3F)大鼠腹腔M1型和M2型巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞分析圖

BMSCs是一種具有組織修復(fù)能力的多能干細(xì)胞，除在神經(jīng)學(xué)、骨學(xué)等學(xué)科發(fā)揮組織修復(fù)功能外[9-10]，還可遷移至炎癥部位，并通過改變免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在寄生蟲感染、敗血癥等疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。研究表明干細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化表型影響疾病的炎癥反應(yīng)過程[14-15]。體外BMSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，BMSCs可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型向M2型分化，發(fā)揮免疫抑制作用[16]。Zhang等[17]證明人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化，促進(jìn)傷口愈合。

本研究結(jié)果顯示，制模后12 h，ANP組大鼠胰腺組織明顯壞死，小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞間隙水腫，紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞大量浸潤。經(jīng)BMSCs治療后，大鼠胰腺組織損傷明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少；TNF-α、IL-1β、MPO血清水平及腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，表明BMSCs通過抑制炎癥因子表達(dá)，減輕ANP大鼠胰腺組織損傷，發(fā)揮一定的治療作用。本研究結(jié)果還顯示，ANP組大鼠M1型與M2型巨噬細(xì)胞比值顯著高于對照組，BMSCs治療組顯著低于ANP組，表明ANP發(fā)生后，巨噬細(xì)胞以M1型為主，BMSCs治療后M1型細(xì)胞顯著減少，提示BMSCs可能通過抑制ANP大鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化來減輕胰腺組織損傷及全身炎癥反應(yīng)。BMSCs是促使ANP大鼠腹腔巨噬細(xì)胞M2型極化還是促進(jìn)M1型轉(zhuǎn)化為M2型，尚需要加大樣本量和延長治療時間進(jìn)一步驗(yàn)證。

然而不同劑量BMSCs發(fā)揮的作用并不相同。本研究應(yīng)用3種劑量(0.5×106、1×106、2×106個細(xì)胞)治療ANP大鼠，結(jié)果顯示，中劑量治療組的治療效果最佳，推測可能與高劑量細(xì)胞引起微循環(huán)細(xì)胞團(tuán)塊栓塞有關(guān)[18]。因此，尋找最佳干細(xì)胞注射劑量可能是發(fā)揮干細(xì)胞最大治療作用的關(guān)鍵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突