徐明，唐澍，劉琦，黃姝娟

郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000

結(jié)直腸癌(CRC)是全世界發(fā)病率最高的癌癥，手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射治療是其主要治療手段，但患者5年生存率較低[1,2]。順鉑(DDP)是CRC治療的常用化療藥物，DDP耐藥是導(dǎo)致CRC治療失敗的重要原因[3,4]。miR-590-3p是一種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的新型微小RNA(miRNA)，可在不同腫瘤中作為促癌因子或者抑癌因子，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。研究表明，miR-590-3p在CRC組織中表達(dá)升高，并可促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]。但是，miR-590-3p是否參與腫瘤細(xì)胞DDP耐藥目前鮮見報(bào)道。2017年3月～2019年8月，本研究觀察了miR-590-3p對CRC細(xì)胞DDP耐藥的影響，并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：CRC細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460均購自美國ATCC細(xì)胞庫。主要試劑：胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，蛋白裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；ULtraRT one step RT-PCR Kit購自北京百奧萊博科技有限公司，蛋白濃度檢測試劑盒和上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑購自美國GlpBio公司，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；miR-590-3p inhibitor、miR-590-3p mimic、NC質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-野生型(wt)質(zhì)粒和pGLO-LRIG1-突變型(mut)質(zhì)粒均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，MDR1、Bax和Bcl-2抗體均購自美國Proteintech公司。miR-590-3p、富含亮氨酸的重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白1(LRIG1)、內(nèi)參U6和GAPDH引物均由美國Invitrogen有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 miR-590-3p高表達(dá)細(xì)胞篩選 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將CRC細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460快速復(fù)蘇，重懸至含有10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的全濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至95%左右時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)的各種細(xì)胞，加入TRIzol試劑進(jìn)行裂解，采用氯仿異丙醇試劑提取的方法提取細(xì)胞總RNA，并檢測RNA濃度及純度合格。按照ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒說明書配制25 μL的反應(yīng)體系：2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL，RNA 1 μL，用無RNA酶的雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。采用7500PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，miR-590-3p上游引物5′- AAAGATTCCAAGAAGCTAAGGGTG-3′(24 bp)，下游引物5′-CCTAACTGGTTTCCTGTGCCTA-3′(22 bp)；內(nèi)參U6上游引物5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(17 bp)，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(20 bp)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-590-3p相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，CRC細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116中miR-590-3p相對表達(dá)量分別為9.84±0.79、10.62±0.87、3.95±0.26，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460為1.00±0.01；3種CRC細(xì)胞中miR-590-3p相對表達(dá)量均高于NCM460細(xì)胞，其中SW620細(xì)胞miR-590-3p相對表達(dá)量最高(P均<0.05)。選取miR-590-3p表達(dá)最高的CRC細(xì)胞系SW620用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 DDP耐藥的SW620細(xì)胞(DDP/SW620細(xì)胞)篩選及驗(yàn)證

1.3.1 DDP/SW620細(xì)胞篩選 采用持續(xù)接觸、濃度遞增的方法篩選DDP/SW620細(xì)胞[7]，最終篩選出加入18 μg/mL DDP的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的SW620細(xì)胞。用含有2 μg/mL DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)該DDP/SW620細(xì)胞，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DDP/SW620細(xì)胞驗(yàn)證 采用CCK-8法。取SW620、DDP/SW620細(xì)胞，以1.5×103/孔接種至96孔板，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的DDP(0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL)，作用48 h。更換含有10 μL CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μL，設(shè)置空白對照孔，孵育1 h，檢測490 nm波長處的光密度(OD)值。細(xì)胞存活率=加藥孔OD值/空白對照孔OD值，計(jì)算兩種細(xì)胞的DDP半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 SW620、DDP/SW620細(xì)胞miR-590-3p表達(dá)檢測 取生長狀況良好的SW620、DDP/SW620細(xì)胞，參照1.2步驟，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-590-3p相對表達(dá)量。

1.5 miR-590-3p對DDP/SW620細(xì)胞DDP耐藥的影響觀察

1.5.1 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證 將DDP/SW620細(xì)胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機(jī)分為miR-590-3p inhibitor組和NC組。細(xì)胞貼壁8 h時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說明書分別轉(zhuǎn)染miR-590-3p inhibitor、NC質(zhì)粒，置于37 ℃、5% CO2的全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6 h，參照1.2步驟，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-590-3p相對表達(dá)量。

1.5.2 細(xì)胞DDP耐藥觀察 兩組轉(zhuǎn)染6 h，分別加入不同終濃度的DDP(0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160 μg/mL)，作用48 h。參照1.3.2步驟，采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，計(jì)算DDP的IC50。

1.6 miR-590-3p對其靶基因的調(diào)控作用觀察 采用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測miR-590-3p的靶基因?yàn)長RIG1，LRIG1啟動(dòng)子區(qū)與miR-590-3p具有結(jié)合位點(diǎn)。①雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將DDP/SW620細(xì)胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機(jī)分為四部分，按照脂質(zhì)體2000說明書分別轉(zhuǎn)染pGLO-LRIG1-wt+NC質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-wt+miR-590-3p mimic質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-mut+NC質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-mut+miR-590-3p mimic質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑說明書檢測細(xì)胞熒光素酶活性。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR法：將DDP/SW620細(xì)胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機(jī)分為兩部分，分別轉(zhuǎn)染miR-590-3p mimic質(zhì)粒和NC質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h，參照1.2步驟，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測LRIG1 mRNA相對表達(dá)量。LRIG1上游引物5′-CTGGACGCGGAGCCTAAAC-3′(19 bp)，下游引物5′- TGTAGGTTCGGCAAGTCCTCA-3′(21 bp)；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′(20 bp)，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′(20 bp)。

1.7 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。兩組轉(zhuǎn)染6 h，加入終濃度為10 μg/mL的DDP，作用48 h。采用Annexin V-FITC/PI染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色，染色5～15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞LRIG1、耐藥相關(guān)基因MDR1和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。兩組轉(zhuǎn)染6 h，加入終濃度為10 μg/mL的DDP，作用48 h。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，裂解完全后高速離心獲取上清總蛋白。檢測蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液煮沸變性；50 μg蛋白加樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，蛋白電濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育PVDF膜1 h。分別加入LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2、內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(稀釋比例均為1∶8 000)，室溫孵育1 h。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光、顯影，采用Image J軟件分析條件灰度值。LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 DDP/SW620細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果 SW620、DDP/SW620細(xì)胞經(jīng)不同濃度DDP作用后的細(xì)胞存活率見圖1。SW620、DDP/SW620細(xì)胞DDP的IC50分別為(1.28±0.17)、(5.68±0.38)μg/mL，二者比較P<0.05。

圖1 SW620、DDP/SW620細(xì)胞經(jīng)不同濃度DDP作用后的細(xì)胞存活率(CCK-8法)

2.2 SW620、DDP/SW620細(xì)胞miR-590-3p表達(dá)比較 SW620、DDP/SW620細(xì)胞miR-590-3p相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、19.54±0.41，二者比較P<0.05。

2.3 兩組miR-590-3p相對表達(dá)量比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組miR-590-3p相對表達(dá)量分別為0.33±0.04、1.00±0.00，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組DDP的IC50比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組經(jīng)不同濃度DDP作用后的細(xì)胞存活率見圖2。miR-590-3p inhibitor組和NC組DDP的IC50分別為(2.46±0.31)、(5.50±0.75)μg/mL，兩組比較P<0.05。

2.5 miR-590-3p對LRIG1的靶向調(diào)控作用觀察結(jié)果 ①雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染pGLO-LRIG1-wt+NC質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-wt+miR-590-3p mimic質(zhì)粒的DDP/SW620細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00±0.01、0.28±0.03，二者比較P<0.01；轉(zhuǎn)染pGLO-LRIG1-mut+NC質(zhì)粒、pGLO-LRIG1-mut+miR-590-3p mimic質(zhì)粒的DDP/SW620細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00±0.05、0.90±0.20，二者比較P>0.05。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-590-3p mimic質(zhì)粒和NC質(zhì)粒的DDP/SW620細(xì)胞LRIG1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.31±0.04、1.00±0.05，二者比較P<0.05。

圖2 兩組經(jīng)不同濃度DDP作用后的細(xì)胞存活率(CCK-8法)

2.6 兩組細(xì)胞凋亡率比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組細(xì)胞凋亡率分別為14.87%±0.39%、3.28%±0.17%，兩組比較P<0.05。見圖3。

圖3 兩組細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))

2.7 兩組LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 miR-590-3p inhibitor組LRIG1、Bax蛋白相對表達(dá)量均高于NC組，MDR1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較

注：與NC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

CRC早期患者經(jīng)根治性手術(shù)切除后預(yù)后相對較好，患者5年生存率為60%左右，但由于CRC早期癥狀不明顯，約20%的患者確診時(shí)伴有轉(zhuǎn)移并處于疾病晚期，從而喪失手術(shù)機(jī)會(huì)；同時(shí)，CRC早期患者在根治性手術(shù)治療后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率為30%左右，目前對于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者主要采取化療，但患者多存在化療耐藥，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)患者5年生存率僅為14.2%[2]。miRNA是一類長18～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，大量研究已經(jīng)證實(shí)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)行為，是抗腫瘤治療的相關(guān)靶點(diǎn)[5]。研究報(bào)告，miR-590-3p在卵巢癌和胃癌等腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的作用[8,9]。而miR-590-3p在乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤組織中呈低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[10,11]。因此，miR-590-3p在不同腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。Feng等[6]報(bào)道，miR-590-3p在CRC細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖和球體形成。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-590-3p在CRC組織中表達(dá)升高，并與患者TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和總體生存率低有關(guān)，過表達(dá)miR-590-3p可促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

目前，關(guān)于miR-590-3p是否參與腫瘤細(xì)胞耐藥的研究比較少。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-590-3p與神經(jīng)膠質(zhì)瘤和膽囊癌細(xì)胞的放射抗性相關(guān)[13,14]。芯片數(shù)據(jù)庫顯示，miR-590-3p可能是影響CRC患者放化療敏感性的miRNA之一[15]。但是，關(guān)于miR-590-3p是否參與CRC細(xì)胞DDP化療耐藥鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CRC細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116中miR-590-3p相對表達(dá)量均高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460，表明CRC細(xì)胞中miR-590-3p表達(dá)升高。本研究中SW620細(xì)胞miR-590-3p相對表達(dá)量最高，因此選擇該細(xì)胞建立DDP耐藥細(xì)胞株；結(jié)果顯示，DDP/SW620細(xì)胞中miR-590-3p相對表達(dá)量及DDP的IC50均高于SW620細(xì)胞，而沉默miR-590-3p表達(dá)后DDP/SW620細(xì)胞DDP的IC50降低，表明miR-590-3p可促進(jìn)CRC細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥。

miRNA可通過與靶信使RNA(mRNA)的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，選擇性靶向mRNA而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。LRIG1是一種跨膜蛋白，可拮抗上皮組織中的表皮生長因子受體信號傳導(dǎo)，屬于抑癌基因[16]。研究報(bào)道，LRIG1參與CRC細(xì)胞西妥昔單抗(CTX)耐藥，其在CTX抗性CRC細(xì)胞中表達(dá)升高，在CTX治療敏感患者中LRIG1表達(dá)與CRC病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[17]。在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-590-3p可通過靶向LRIG1基因，促進(jìn)細(xì)胞的放射抗性[13]。本研究采用TargetScan7.2預(yù)測軟件和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)均證實(shí)在CRC細(xì)胞中LRIG1是miR-590-3p的靶基因。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-590-3p表達(dá)后DDP/SW620細(xì)胞LRIG1蛋白表達(dá)升高；這提示miR-590-3p可能通過靶向LRIG1參與CRC細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥，但是其具體的分子機(jī)制仍需深入研究。

化療藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機(jī)制之一[18]。腫瘤細(xì)胞耐藥的主要機(jī)制與跨膜蛋白的過表達(dá)密切相關(guān)，這些蛋白質(zhì)可以直接降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度。MDR1也稱為P-糖蛋白，是第一個(gè)被確認(rèn)為人類哺乳動(dòng)物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的多藥耐藥[19]。Bcl-2是重要的抗凋亡相關(guān)蛋白，是Bcl-2家族中最重要的基因，其通過降低凋亡蛋白酶激活而促進(jìn)細(xì)胞存活。同時(shí)Bcl-2可被促凋亡蛋白Bax調(diào)控，放化療主要是通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-590-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均高于NC組，MDR1、Bcl-2蛋白表達(dá)均低于NC組，表明干擾miR-590-3p表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低耐藥相關(guān)基因MDR1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。

綜上所述，miR-590-3p可促進(jìn)CRC細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥，其機(jī)制可能與負(fù)性調(diào)控LRIG1進(jìn)而促進(jìn)MDR1表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。