邵淑娟，王宏利，杜巍，李紅霞，汪方園，王亞娟，霍志平

河北中石油中心醫(yī)院，河北廊坊065000

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚未完全探明，可能與多基因、多因素共同作用有關(guān)[2]。miRNA是一類長度為18～22個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能特異識別3′-非轉(zhuǎn)錄區(qū)的mRNA，抑制或者降解相應(yīng)mRNA表達，從而發(fā)揮調(diào)控靶基因的作用[3]。miR-224是被研究較多的miRNA之一。研究證實，miR-224在喉癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤細胞中表達異常[4]，且可通過調(diào)控正五聚蛋白3(PTX3)等基因參與惡性腫瘤進展[5]。但目前miR-224在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達變化及其作用機制鮮見報道。2019年1～3月，本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌細胞miR-224表達變化及過表達miR-224對細胞生物學行為的影響，并探討其可能的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人子宮內(nèi)膜癌JEC、HEC-1B細胞及人子宮內(nèi)膜上皮HEECs細胞均由美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，人子宮內(nèi)膜癌KLE、Ishikawa細胞由中科院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。主要試劑：LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，TRIzol試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，實時熒光定量試劑盒購自上海信裕生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，Transwell小室購自美國Corning公司；PTX3購自美國 R&D公司，二抗購自美國Santa Cruz公司；miR-224引物、U6引物、miR-224模擬物(miR-224 mimics)、模擬物陰性對照(mimics-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計合成。

1.2 miR-224低表達細胞篩選 采用實時熒光定量PCR法。將JEC、HEC-1B、HEECs細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，KLE、Ishikawa細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)，均采用5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。采用TRIzol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度及純度合格。取100 ng總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-224上游引物5′-GGGCAAGTCACTAGTGGTTC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參U6上游引物5′-ATACAGAGAAAGTTAGCACGG-3′，下游引物5′-GGAATGCTTCAAAGAGTTGTG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-224相對表達量。結(jié)果顯示，人子宮內(nèi)膜癌JEC、HEC-1B、KLE、Ishikawa細胞miR-224相對表達量分別為0.51±0.11、0.49±0.09、0.34±0.06、0.21±0.10，均明顯低于人子宮內(nèi)膜上皮HEECs細胞中的1.04±0.09(P均<0.01)。選擇miR-224相對表達量最低的Ishikawa細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組處理及miR-224表達檢測 取生長狀態(tài)良好的Ishikawa細胞，當細胞融合至40%～60%時，隨機分為miR-224 mimics組和mimics-NC組。兩組按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別轉(zhuǎn)染miR-224 mimics、mimics-NC。轉(zhuǎn)染24 h后，參照1.2，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞miR-224相對表達量。

1.4 細胞生物學行為觀察

1.4.1 細胞增殖能力 采用CCK-8法。兩組轉(zhuǎn)染24 h，配制2×104/mL的細胞懸液，每孔100 μL接種至96孔板上。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h加入10 μL 10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。使用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.4.2 細胞凋亡能力 采用流式細胞術(shù)。兩組轉(zhuǎn)染24 h，配制1×105/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液置入流式管內(nèi)，分別加入5 μL PI及10 μL Annexin V-FITC進行Annexin V-FITC/PI雙染，輕晃搖勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.3 細胞侵襲、遷移能力 采用Transwell侵襲和遷移實驗。兩組轉(zhuǎn)染24 h，配制1×105/mL的細胞懸液。Transwell侵襲實驗：將Transwell小室底部預(yù)先鋪基質(zhì)膠，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出小室，棉簽輕輕拭去未穿膜細胞;4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色，高倍顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。Transwell遷移實驗：Transwell小室底部不預(yù)先鋪基質(zhì)膠，其余步驟參照侵襲實驗。

1.5 細胞PTX3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。兩組轉(zhuǎn)染24 h，取細胞提取總蛋白，上樣后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入PTX3、內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比例1∶500)，4 ℃孵育過夜。滴入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗(稀釋比例1∶2 000)，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、定影、顯影，Quality One軟件分析條帶灰度值。以PTX3與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值計算PTX3蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞miR-224表達比較 miR-224 mimics組、mimics-NC組miR-224相對表達量分別為6.48±0.22、0.95±0.06，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組不同時間點細胞增殖能力比較 隨著作用時間的延長，兩組OD值均呈升高趨勢。miR-224 mimics組培養(yǎng)24、48、72、96 h的OD值均明顯低于mimics-NC組同時間點(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同時間點細胞增殖能力比較

注：與mimics-NC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 兩組細胞凋亡率比較 miR-224 mimics組、mimics-NC組細胞凋亡率分別為19.36%±3.21%、5.46%±0.75%，兩組比較P<0.01。見圖1。

注：A為mimics-NC組,B為miR-224 mimics組。

圖1 兩組細胞凋亡率比較(流式細胞術(shù))

2.4 兩組穿膜細胞數(shù)比較 miR-224 mimics組、mimics-NC組侵襲實驗穿膜細胞數(shù)分別為(110±19)、(225±25)個，遷移實驗穿膜細胞數(shù)分別為(205±18)、(375±39)個，兩組比較P均<0.05。見圖2。

圖2 兩組侵襲與遷移實驗結(jié)果比較

2.5 兩組PTX3蛋白表達比較 miR-224 mimics組、mimics-NC組PTX3蛋白相對表達量分別為0.26±0.12、2.15±0.31，兩組比較P<0.05。見圖3。

圖3 兩組PTX3蛋白表達比較(Western blotting法)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌系婦科常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病呈年輕化趨勢。1/3以上子宮內(nèi)膜癌患者確診時已進展為中晚期，放化療等治療效果不佳。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚不清楚，但其發(fā)生及疾病進展均與某些基因的異常表達有關(guān)，如抑癌基因表達降低、原癌基因表達活化等。miR-224是miRNA中被研究較多的基因之一，其在結(jié)直腸癌[6]、胰腺癌[7]、非小細胞肺癌[8]和膀胱癌[9]等組織或細胞中表達升高，參與了上述惡性腫瘤的發(fā)生，并與患者臨床進展和預(yù)后有關(guān)[10,11]；但其在前列腺癌[12]和葡萄膜惡性黑色素瘤[13]等組織或細胞中表達下降，能夠抑制上述惡性腫瘤的發(fā)生。目前關(guān)于miR-224與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的相關(guān)研究甚少。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌JEC、HEC-1B、KLE、Ishikawa細胞中miR-224表達均明顯低于子宮內(nèi)膜上皮HEECs細胞，提示miR-224可能作為抑癌基因參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。

惡性腫瘤最顯著的生物學特性是不受控制的增殖、凋亡減慢以及侵襲和轉(zhuǎn)移，通過基因干擾或者藥物治療恢復異常表達的基因，從而抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是目前的研究熱點。研究表明，miR-224的異常表達與惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學行為有關(guān)，miR-224能夠促進或者抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，并且能夠影響腫瘤對放化療的敏感性[14～17]。Lu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-224表達能夠抑制口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲。Yu等[5]報道，敲除miR-224基因可通過上調(diào)CASP9蛋白表達，參與抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。在膠質(zhì)母細胞瘤[15]和結(jié)腸癌[16]中，miR-224表達能夠影響腫瘤細胞對放化療的敏感性。本研究選擇miR-224表達最低的Ishikawa細胞作為研究對象，借助基因干擾技術(shù)過表達細胞miR-224表達；結(jié)果顯示，過表達miR-224的Ishikawa細胞增殖活性明顯降低、凋亡率升高、侵襲及遷移能力顯著降低，提示miR-224作為抑癌基因參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞的生物學行為。

PTX3屬長鏈正五聚蛋白，是一類免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，又稱腫瘤壞死因子刺激基因14，在機體炎癥反應(yīng)、免疫防御、動脈粥樣硬化等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，PTX3在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTX3在子宮內(nèi)膜癌組織中表達升高，抑制子宮內(nèi)膜癌細胞中PTX3基因表達能夠抑制細胞增殖及侵襲、遷移，并能夠促進細胞凋亡[19]。Yu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-224能夠通過靶向PTX3基因抑制宮頸癌細胞的增殖及侵襲。miR-224能夠通過靶向PTX3影響卵母細胞的成熟[20]。一項關(guān)于內(nèi)耳損傷相關(guān)炎癥反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-224能夠靶向PTX3誘導自身免疫系統(tǒng)激活[21]。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-224可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細胞中PTX3蛋白表達，提示miR-224對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響可能與PTX3有關(guān)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌細胞miR-224表達降低，過表達miR-224可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲及遷移，并誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制PTX3蛋白表達有關(guān)。