崔長升 于淼 王任晶 趙晉瑩 劉莉 汪瑩 閆凱莉 齊濱 趙大慶

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1藥學(xué)院，吉林 長春 130117；2針灸推拿學(xué)院；3吉林省人參科學(xué)研究院)

《中國藥典》中記載，鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的功效，用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、羸瘦、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、腰脊冷痛、筋骨痿軟、崩漏帶下、陰疽不斂〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，鹿茸具有抗應(yīng)激、緩解骨質(zhì)疏松、減肥降脂、抗氧化和抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等功效，可調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等〔2～4〕。鹿茸中主要含有氨基酸、脂類、多肽、多糖、多胺、無機(jī)元素、蛋白質(zhì)、激素樣物質(zhì)、生物堿基等化學(xué)成分〔5～8〕，其中多糖是活主要性成分之一。鹿茸多糖能夠提高機(jī)體的全面免疫功能，提高防御能力及抗腫瘤能力〔9〕。本研究擬系統(tǒng)研究梅花鹿鹿茸多糖的提取工藝，并對(duì)其抗衰老的活性進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1材料 超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT )活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成科技有限公司；D-半乳糖購自上?；菔郎噭┯邢薰?；D-無水葡萄糖(批號(hào) 201704)購自中國食品藥品檢定研究院；其他試劑為分析純。梅花鹿鹿茸藥材采自吉林省長春市雙陽鹿場，由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定為鹿科動(dòng)物梅花鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。樣品留存于長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)購自日本島津公司；DZF-6050型電熱恒溫真空干燥箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ST-40R型高速冷凍離心機(jī)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MS204S 型分析天平購自瑞士梅特勒-托利多公司；酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro型)、石蠟切片機(jī)(RM2235型)購自德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司；自動(dòng)包埋機(jī)(EG1150H型)、烘片機(jī)(HI1220型)、鋪片機(jī)(HI1210型)購自德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司；體視顯微鏡(SMZ25型)購自北京恒三江儀器銷售有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種SPF級(jí)小鼠〔動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2016-0003〕，雌雄各半，體重(20±2)g，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3鹿茸多糖提取工藝的優(yōu)化 按文獻(xiàn)〔10〕及課題組前期單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比，提取時(shí)間，提取次數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，以多糖提取率作為考察指標(biāo)，多糖的含量測定采用苯酚硫酸法，實(shí)驗(yàn)因素水平分配見表1。

表1 因素水平表

1.4鹿茸多糖的提取 取一定量鹿茸粉末，石油醚浸泡12 h脫脂，之后加55倍體積 0.2 mol/L pH8.0 磷酸鹽緩沖液100 ℃提取2 h，4 000 r/min離心15 min，連續(xù)提取2次，合并上清液，濃縮到原體積的1/3～2/3，加入3倍體積95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?℃浸泡12 h，離心，收集醇沉物，至通風(fēng)處晾干后，將沉淀物加水復(fù)溶，用sevage法除蛋白2～3次，透析48 h，濃縮，冷凍干燥得鹿茸多糖。

1.5動(dòng)物分組及造模給藥 實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱重、編號(hào)后開始正式試驗(yàn)。50只小鼠隨機(jī)分成空白(Control)組，老年模型(AM)組，鹿茸多糖低劑量(LR-L)組，鹿茸多糖中劑量(LR-M)組和鹿茸多糖高劑量組(LR-H)，雌雄各5只。Control組以等體積的蒸餾水灌胃，其他組頸背部皮下注射D-半乳糖〔給藥劑量為130 mg/(kg·d)〕30 d，AM組灌胃蒸餾水10 ml/(kg·d)，LR-L、LR-M、LR-H組每天分別灌胃濃度為125 mg/kg、250 mg/kg和500 mg/kg的鹿茸多糖樣品，共30 d。

1.6生化指標(biāo)檢測 給藥后30 d禁食不禁水，12 h后，各組按1.5項(xiàng)下給藥，30 min后脫頸處死，摘眼球取血0.5～1.0 ml，4℃低溫離心、收集血清并保存。按照試劑盒規(guī)定的方法測定SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量。

1.7組織切片觀察 肝臟于4%多聚甲醛中固定，用于組織切片觀察。48 h后，從固定液中取出肝組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，包埋，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察〔11〕。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化鹿茸多糖的提取工藝 以多糖提取率為指標(biāo)，對(duì)料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察。結(jié)果見表2。不考慮交互作用，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由R值可知，各因素影響的大小依次為料液比>提取時(shí)間>提取次數(shù)。通過方差分析可知，3個(gè)因素中，料液比、提取時(shí)間具有顯著影響(P<0.05)，提取次數(shù)不顯著。綜合分析，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化的鹿茸多糖最佳提取工藝為料液比1∶15，水浴回流100℃提取2次，每次2 h。鹿茸多糖的提取率為1.6%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

k1、k2、k3為均值；R為極差

表3 方差分析結(jié)果

2.2體征和行為觀察結(jié)果 正式實(shí)驗(yàn)前各組活動(dòng)、飲食正常、毛色光亮。D-半乳糖造模30 d后，與Control組相比，AM組少動(dòng)、飲食減少、體重減輕，毛色灰暗、豎毛，開始呈現(xiàn)衰老體征。給藥鹿茸多糖30 d后，與AM組對(duì)比，鹿茸多糖各劑量組活潑、皮毛較光亮、飲食正常，與Control組相比，行為體征無明顯差異。

2.3血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果 AM組與Control組相比，血清中GSH-Px、SOD、CAT活力明顯下降(P<0.01,P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與AM組相比，LR-H組、LR-M組及LR-L組可顯著提高SOD，CAT和GSH-Px的活力(P<0.01)及降低MDA含量(P<0.01，P<0.05)。見表4。

2.4鹿茸多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 Control組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞相互連接形成肝板，以中央動(dòng)脈為中心向周圍呈輻射狀形成肝小葉，肝細(xì)胞之間空隙形成肝血竇，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核較大，核仁明顯，無炎性細(xì)胞浸潤。AM組肝細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞較多，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞界限模糊，肝血竇不明顯，染色質(zhì)固縮；LR-L、LR-M組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，著色清晰，肝板排列不整齊，炎性細(xì)胞浸潤減輕，染色質(zhì)固縮現(xiàn)象緩解；LR-H組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，著色清晰，肝血竇明顯，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限明顯，胞核胞質(zhì)未發(fā)現(xiàn)異常，形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。見圖1。

表4 鹿茸多糖對(duì)SOD、CAT、GSH-Px的活力和MDA的含量影響

與AM組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

箭頭表示炎性細(xì)胞圖1 各組肝組織切片(HE，×200)

3 討 論

鹿茸作為珍貴的滋補(bǔ)藥材，具有補(bǔ)虛作用，抗衰老，壯腎陽，益精血，增強(qiáng)免疫力等功效〔12〕，隨著研究的深入，對(duì)鹿茸多糖等成分的研究越來越引起國內(nèi)外研究人員的重視。以往鹿茸多糖的提取多采用超聲、水煎煮的方法〔13〕，緩沖鹽溶液作為溶劑提取，sevage法除蛋白，透析，與現(xiàn)有工藝相比〔14，15〕，所得鹿茸多糖純度、提取率較高。

長期給小鼠注射一定劑量的D-半乳糖，會(huì)在體內(nèi)代謝得到大量的半乳糖醇，不能被進(jìn)一步代謝因而堆積起來，影響細(xì)胞正常的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂〔16〕。通過大量的文獻(xiàn)檢索與對(duì)比，目前我國建立衰老模型最常用的方法是皮下注射一定劑量的D-半乳糖〔17〕。董會(huì)萍〔18〕研究發(fā)現(xiàn)最佳D-半乳糖小鼠衰老模型的劑量為120～150 mg/(kg·d)，頸部皮下注射與腹腔注射無明顯差異。故本實(shí)驗(yàn)采用頸部皮下注射D-半乳糖致衰老模型，給藥劑量為130 mg/(kg·d)。過量的D-半乳糖破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，從而造成機(jī)體自由基失衡。SOD、CAT及GSH-Px活性高低的變化反映了機(jī)體抗氧化能力的大小，活性越高，抗氧化能力越強(qiáng)，MDA 含量的高低反映了機(jī)體自由基累積及脂質(zhì)過氧化損傷的程度，常使用以上4個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)抗氧化能力〔19,20〕。D-半乳糖可導(dǎo)致衰老的同時(shí)，也會(huì)致肝損傷，肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，本文同時(shí)觀察各組小鼠肝組織的病理變化〔21,22〕。

本研究表明鹿茸多糖具有抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除體內(nèi)自由基有關(guān)。